【摘要】：研究背景骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis,OP)是一種以骨量低下,骨微結(jié)構(gòu)破壞,導(dǎo)致骨脆性增加而易發(fā)生骨折為特征的全身性骨骼疾病。機(jī)體在發(fā)生骨質(zhì)疏松的過程中,骨形成和骨吸收之間的動(dòng)態(tài)平衡發(fā)生紊亂,并逐漸形成惡性循環(huán),致使骨折易感性明顯增加。同時(shí),骨質(zhì)疏松癥作為一種退化性疾病,其發(fā)病率同增齡密切相關(guān),隨著人類壽命延長和人口老齡化的加劇,骨質(zhì)疏松癥已成為人類面臨的嚴(yán)要公共健康問題。因此,針對骨質(zhì)疏松及其并發(fā)癥治療方法的研究成為當(dāng)前研究的重點(diǎn)。硅元素作為人體內(nèi)重要的必需微量元素,其與骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。硅元素可能同維生素D的作用一樣,能夠顯著提高骨礦化的速度。既往研究發(fā)現(xiàn)飲食中缺乏硅元素易導(dǎo)致骨骼發(fā)育異常而出現(xiàn)骨密度下降。因原硅酸(Orthosilicic Acid)具有低分子量和良好水溶性的特點(diǎn),所以原硅酸是目前發(fā)現(xiàn)的最適合被人類和動(dòng)物吸收的硅元素形式。近期有相關(guān)研究證實(shí)骨形態(tài)發(fā)生蛋白(BMP)在原硅酸介導(dǎo)的成骨分化過程中發(fā)揮了重要作用,但是否存在其它非經(jīng)典BMP通路參與原硅酸介導(dǎo)的骨分化過程目前尚未完全闡明。既往研究多次證實(shí)PI3K-Akt-mTOR信號通路對成骨分化過程具有正向調(diào)節(jié)的作用。然而當(dāng)前的骨分化研究領(lǐng)域中尚未出現(xiàn)關(guān)于原硅酸介導(dǎo)的成骨分化過程同PI3K-Akt-mTOR信號通路之間關(guān)系的研究。因此,本研究主要內(nèi)容為原硅酸分別作用于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞(adipose-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)和人成骨樣細(xì)胞(MG-63和U2-OS)后檢測相關(guān)成骨指標(biāo)和PI3K-Akt-mTOR信號通路的表達(dá)變化,探究原硅酸對ADMSCs和人成骨樣細(xì)胞骨分化的影響及其同PI3K-Akt-mTOR信號通路之間的關(guān)系。同時(shí),因ADMSCs具有多向分化的潛能,本研究進(jìn)一步檢測了原硅酸作用于ADMSCs后與破骨分化密切相關(guān)的RANKL/OPG信號通路的變化,探究原硅酸對ADMSCs在破骨分化方面的作用機(jī)制。本研究的創(chuàng)新點(diǎn):1.首次探究原硅酸作用于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞和人成骨樣細(xì)胞后其骨分化作用和PI3K-Akt-mTOR信號通路之間的關(guān)系;2.首次將原硅酸作用于脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞,并從成骨分化和破骨分化兩方面探究原硅酸在骨分化過程中的作用機(jī)制。本研究結(jié)果將為原硅酸和ADMSCs聯(lián)合應(yīng)用于骨質(zhì)疏松及并發(fā)癥的治療提供線索,同時(shí)為原硅酸用于骨質(zhì)疏松癥的治療提供新的理論依據(jù)。第一部分原硅酸體外通過PI3K-Akt-mTOR通路和RANKL/OPG通路影響脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞骨分化機(jī)制的研究研究目的(1)檢測原硅酸對ADMSCs的細(xì)胞活性的影響。(2)檢測原硅酸對ADMSCs骨分化的影響。(3)探究原硅酸影響ADMSCs骨分化過程中可能存在的作用機(jī)制。研究方法(1)為驗(yàn)證所購買ADMSCs的穩(wěn)定性,取第6代生長狀態(tài)良好的ADMSCs應(yīng)用茜素紅S染色及油紅O染色鑒定其成骨及成脂分化能力;同時(shí),應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)鑒定第6代ADMSCs表面特異性標(biāo)志物。(2)應(yīng)用不同濃度原硅酸作用于ADMSCs 1d、3d、5d、7d后,用CCK-8法檢測ADMSCs的細(xì)胞活性。(3)應(yīng)用Wstern blot技術(shù)檢測不同濃度原硅酸作用于ADMSCs 7d后相關(guān)成骨分化指標(biāo)(COL1和RUNX2)的變化情況,分析COL1和RUNX2的表達(dá)同原硅酸作用濃度之間的關(guān)系,并從中探索最適誘導(dǎo)ADMSCs成骨分化的原硅酸濃度。(4)應(yīng)用茜素紅S染色方法檢測原硅酸作用于ADMSCs 28d后鈣結(jié)節(jié)的生成情況。(5)應(yīng)用Wstern blot技術(shù)檢測不同濃度原硅酸作用于ADMSCs 7d后PI3K-Akt-mTOR信號通路的變化,并分析其變化同原硅酸作用濃度之間的關(guān)系。(6)應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測原硅酸作用于 ADMSCs 7d后細(xì)胞內(nèi)P-Ak t和P-mTOR表達(dá)情況,進(jìn)一步驗(yàn)證原硅酸對PI3K-Akt-mTOR信號通路的影響。(7)根據(jù)有無原硅酸和PI3K抑制劑LY294002,將細(xì)胞分為如下4組:對照組,對照+LY294002組,原硅酸組,原硅酸+LY294002組。應(yīng)用Wstern blot技術(shù)檢測4組中PI3K-Akt-mTOR信號通路和成骨分化指標(biāo)(COL1、RUNX2)的表達(dá),分析原硅酸介導(dǎo)的ADMSCs成骨分化同PI3K-Akt-mTOR信號通路之間的關(guān)系。(8)按上述分組,應(yīng)用BCIP/NBT堿性磷酸酶(ALP)顯色法,檢測原硅酸和LY294002對成骨分化指標(biāo)ALP表達(dá)的影響,進(jìn)一步探究原硅酸介導(dǎo)的ADMSCs成骨分化同PI3K-Akt-mTOR信號通路之間的關(guān)系。(9)應(yīng)用Wstern blot技術(shù)檢測不同濃度原硅酸作用于ADMSCs 7d后RANKL和OPG的表達(dá),分析RANKL和OPG的表達(dá)同原硅酸作用濃度的關(guān)系并從中根據(jù)RANKL/OPG的比值探索最佳抑制ADMSCs向破骨分化的原硅酸濃度。(10)根據(jù)有無活性蛋白sRANKL和原硅酸將細(xì)胞分為如下3組:對照組,sRANKL組,sRANKL+原硅酸組。應(yīng)用Wstern blot技術(shù)檢測相關(guān)破骨分化指標(biāo)(NFATc1、CALCR、CTSK)的表達(dá),分析原硅酸在sRANKL介導(dǎo)的ADMSCs破骨分化過程中所起的作用。(11)按上述分組,應(yīng)用抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)染色法檢查原硅酸和sRANKL對破骨分化指標(biāo)TRACP表達(dá)的影響,進(jìn)一步分析原硅酸在sRANKL介導(dǎo)的ADMSCs破骨分化過程中所起的作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)第6代ADMSCs經(jīng)成骨和成脂誘導(dǎo)后,兩種染色結(jié)果均為陽性;同時(shí)經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)對其細(xì)胞表面特異蛋白鑒定,結(jié)果示CD90陽性率大于90%,CD45和CD11陽性率均小于5%。表明ADMSCs具有成骨和成脂分化的能力,同時(shí)具備間充質(zhì)干細(xì)胞的表面特征。(2)ADMSCs的細(xì)胞活性未隨著原硅酸的作用濃度和時(shí)間的變化而變化。表明原硅酸(≤40 μM)對ADMSCs的細(xì)胞活性無明顯影響。(3)原硅酸能夠上調(diào)COL1和RUNX2的表達(dá)。當(dāng)原硅酸濃度為20 μM時(shí),COL1和RUNX2的上調(diào)均最顯著,可作為最適誘導(dǎo)ADMSCs成骨分化的原硅酸濃度。(4)原硅酸(20 μM)作用ADMSCs 28d后,能顯著促進(jìn)鈣結(jié)節(jié)的生成。(5)原硅酸能夠上調(diào)PI3K、P-Akt、P-mTOR的表達(dá)。當(dāng)原硅酸濃度為20 μM時(shí),P-Akt的上調(diào)最顯著。而總Akt和總mTOR的表達(dá)未隨著原硅酸的濃度變化而出現(xiàn)顯著變化。(6)原硅酸能顯著提高P-Akt和P-mTOR的熒光陽性細(xì)胞數(shù)和熒光強(qiáng)度。此結(jié)果同Wstern blot結(jié)果趨勢一致。(7)原硅酸能夠上調(diào)PI3K、P-Akt、P-mTOR、COL1和RUNX2的表達(dá),當(dāng)加用PI3K抑制劑LY294002后,上述蛋白的表達(dá)均呈現(xiàn)下調(diào)。表明PI3K-Akt-mTOR信號通路被抑制后,原硅酸對ADMSCs的成骨分化作用也被抑制。(8)原硅酸能夠增加ALP的表達(dá),當(dāng)加用LY294002后ALP的表達(dá)被抑制。此結(jié)果同其它成骨分化指標(biāo)(COL1和RUNX2)的結(jié)果趨勢一致。再次證實(shí)PI3K-Akt-mTOR信號通路在原硅酸介導(dǎo)的ADMSCs成骨分化過程中起到正向調(diào)節(jié)作用。(9)原硅酸能夠下調(diào)RANKL和上調(diào)OPG的表達(dá)。此結(jié)果表明原硅酸通過降低RANKL/OPG的比值,抑制ADMSCs向破骨分化。當(dāng)原硅酸濃度為20 u M時(shí)RANKL/OPG的比值最低,此濃度可作為抑制ADMSCs向破骨分化的最適濃度。(10)sRANKL能夠上調(diào)破骨分化指標(biāo)NFATc1、CALCR、CTSK的表達(dá),當(dāng)加用原硅酸一同作用后,上述指標(biāo)的表達(dá)均出現(xiàn)下調(diào)。表明原硅酸能夠抑制sRANKL介導(dǎo)的ADMSCs破骨分化過程。(11)sRANKL能夠使TRACP染色陽性反應(yīng)增強(qiáng)且陽性細(xì)胞數(shù)增加,當(dāng)加用原硅酸一同作用后,TRACP染色陽性反應(yīng)減弱且陽性細(xì)胞數(shù)減少。本結(jié)果再次驗(yàn)證原硅酸能夠抑制sRANKL介導(dǎo)的破骨分化過程。實(shí)驗(yàn)結(jié)論(1)原硅酸(≤40 μM)對ADMSCs的細(xì)胞活性無明顯影響。(2)原硅酸能夠上調(diào)成骨分化指標(biāo)(RUNX2、COL1和ALP)的表達(dá),促使ADMSCs向成骨分化。(3)原硅酸在促進(jìn)ADMSCs成骨分化過程中能夠激活PI3K-Akt-mTOR信號通路。當(dāng)此通路被抑制時(shí)成骨分化過程亦被抑制,說明PI3K-Akt-mTOR信號通路在原硅酸介導(dǎo)的ADMSCs成骨分化過程中發(fā)揮了正向調(diào)節(jié)作用。(4)原硅酸能夠下調(diào)RANKL和上調(diào)OPG的表達(dá),降低RANKL/OPG的比值,抑制ADMSCs向破骨分化。(5)原硅酸能夠抑制活性蛋白sRANKL介導(dǎo)的ADMSCs向破骨分化,使相關(guān)破骨分化指標(biāo)(NFATc1、CALCR,CTSK和TRACP)的表達(dá)下調(diào)。此結(jié)果更進(jìn)一步表明,原硅酸不僅能夠降低RANKL的表達(dá),而且能夠抑制RANKL介導(dǎo)的破骨分化作用。第二部分原硅酸體外通過P13K-Akt-mTOR通路促進(jìn)人成骨樣細(xì)胞成骨及其機(jī)制的研究研究目的(1)檢測原硅酸對兩種人成骨樣細(xì)胞(MG-63和U2-OS)的細(xì)胞活性的影響。(2)檢測原硅酸對人成骨樣細(xì)胞的成骨作用。(3)探究原硅酸介導(dǎo)的成骨過程中同PI3K-Akt-mTOR信號通路之間的關(guān)系。研究方法(1)應(yīng)用不同濃度原硅酸分別作用于MG-63和U2-OS 72h,用CCK-8方法檢測細(xì)胞活性。(2)應(yīng)用Wstern blot技術(shù)檢測不同濃度原硅酸作用于MG-63和U2-OS 72h后成骨指標(biāo)(COL1和RUNX2)的變化情況,分析COL1和RUNX2的表達(dá)同原硅酸濃度的關(guān)系并從中探索最適促進(jìn)兩種人成骨樣細(xì)胞成骨的原硅酸濃度。(3)應(yīng)用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)檢測原硅酸作用于MG-63和U2-OS 72h后細(xì)胞內(nèi)P-Akt和P-mTOR表達(dá)情況,探究原硅酸對PI3K-Akt-mTOR信號通路的影響。(4)根據(jù)有無原硅酸和LY294002將細(xì)胞分為如下4組:對照組,對照+LY294002組,原硅酸組,原硅酸+LY294002組。應(yīng)用Wstern blot技術(shù)檢測4組中PI3K-Akt-mTOR信號通路和成骨指標(biāo)(COL1和RUNX2)的表達(dá),分析原硅酸介導(dǎo)的成骨過程同PI3K-Akt-mmTOR信號通路之間的關(guān)系。(5)按上述分組,應(yīng)用BCIP/NBT堿性磷酸酶顯色法檢測原硅酸和LY294002對成骨指標(biāo)ALP表達(dá)的影響,分析其同PI3K-Akt-mTOR信號通路之間的關(guān)系。(6)按上述分組,應(yīng)用堿性磷酸酶微量酶標(biāo)法進(jìn)一步檢測原硅酸和LY294002對ALP活性的影響,探尋原硅酸長時(shí)間作用7d后,ALP的活性同PI3K-Akt-mTOR信號通路之間的關(guān)系。(7)按上述分組,應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞上清液中原硅酸和LY294002對OCN和P1NP表達(dá)的影響,進(jìn)一步檢測原硅酸成骨過程中OCN和P1NP的表達(dá)同PI3K-Akt-mTOR信號通路之間的關(guān)系。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)MG-63和U2-OS的細(xì)胞活性未隨著原硅酸濃度變化而變化。表明72h內(nèi)原硅酸(濃度≤40 μM)對MG-63和U2-OS的細(xì)胞活性均無明顯影響。(2)原硅酸能上調(diào)COL1和RUNX2的表達(dá)。當(dāng)原硅酸濃度為10 μM時(shí),COL1和RUNX2的上調(diào)均最顯著,可作為最適促進(jìn)成骨的原硅酸濃度。(3)原硅酸能顯著提高M(jìn)G-63和U2-OS中P-Akt和P-mTOR的熒光陽性細(xì)胞數(shù)和熒光強(qiáng)度。(4)原硅酸能夠使PI3K、P-Akt、P-mTOR、COL1和RUNX2的表達(dá)均上調(diào),加用LY294002后上述蛋白的表達(dá)均下調(diào)。表明PI3K-Akt-mTOR信號通路在原硅酸介導(dǎo)的成骨過程中起到正向調(diào)節(jié)作用。(5)原硅酸作用MG-63和U2-OS 72h后ALP的表達(dá)均增加,加用LY294002后ALP的表達(dá)被抑制。此結(jié)果同COL1和RUNX2的表達(dá)趨勢一致。進(jìn)一步驗(yàn)證原硅酸介導(dǎo)的成骨過程中,PI3K-Akt-mTOR信號通路起到了積極作用。(6)原硅酸長時(shí)間作用MG-63和U2-OS 7d后ALP的活性增強(qiáng),加用LY294002后ALP的活性減弱。在原硅酸分別作用72h和7d后,ALP的表達(dá)趨勢一致,這體現(xiàn)出ALP是成骨早期和中期的重要指標(biāo),說明PI3K-Akt-mTOR信號通路在原硅酸介導(dǎo)的成骨早期和中期均發(fā)揮了積極作用。(7)原硅酸能夠使分泌蛋白OCN和P1NP的表達(dá)升高,加用LY294002后OCN和P1NP的表達(dá)均降低。P1NP作為COL1合成前期的分解產(chǎn)物,同COL1的表達(dá)趨勢一致。此結(jié)果進(jìn)一步表明PI3K-Akt-mTOR信號通路在原硅酸介導(dǎo)的成骨過程中發(fā)揮了重要作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)論(1)原硅酸(≤40 μ M)作用人成骨樣細(xì)胞(MG-63和U2-OS)72h,對細(xì)胞活性無明顯影響。(2)原硅酸能夠促進(jìn)成骨指標(biāo)(RUNX2、COL1、ALP、OCN和P1NP)的表達(dá),對成骨過程發(fā)揮積極作用。(3)原硅酸在促進(jìn)成骨過程中能夠激活PI3K-Akt-mTOR信號通路。(4)PI3K-Akt-mTOR信號通路參與了原硅酸介導(dǎo)的成骨過程,并在其中發(fā)揮了正向調(diào)節(jié)作用。
【圖文】：

邐山東大學(xué)博士學(xué)位論文邐逡逑附圖表逡逑■■圖１：邋ＡＤＭＳＣｓ的培養(yǎng)及成骨、成脂分化鑒定。（ａ）第６代ＡＤＭＳＣｓ形態(tài)呈長梭形，逡逑并近乎旋渦狀排列；（ｂ）第６代ＡＤＭＳＣｓ成骨誘導(dǎo)２８ｄ后，茜素紅Ｓ鈣結(jié)節(jié)染色逡逑示細(xì)胞外基質(zhì)可見深紅色的鈣結(jié)節(jié)形成；（ｃ）第６代ＡＤＭＳＣｓ成脂誘導(dǎo)１４ｄ后，逡逑油紅０染色示胞質(zhì)內(nèi)脂滴被染成鮮紅色。標(biāo)尺均為５００邋ｕ邋ｍ。逡逑＜？ｊ邐｜邋１００－逡逑

和ＴＲＡＣＰ）的表達(dá)均出現(xiàn)上調(diào)，說明ｓＲＡＮＫＬ進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)定發(fā)揮了其促進(jìn)破骨逡逑分化的作用；但當(dāng)原硅酸同ｓＲＡＮＫＬ共同作用ＡＤＭＳＣｓ后，上述破骨分化指標(biāo)的表逡逑達(dá)卻出現(xiàn)了下調(diào)，說明原硅酸具有抑制ｓＲＡＮＫＬ介導(dǎo)的破骨分化作用（圖１１、１２）。逡逑既往相關(guān)研宄中，Ｍｌａｄｅｎｏｖｉｃ邋Ｚ，邋ｅｔ邋ａｌ．從ｍ邋ＲＮＡ水平同樣發(fā)現(xiàn)可溶性的二氧化逡逑硅在體外能夠抑制破骨細(xì)胞的形成及骨吸收［９３］。而本研宄則是在脂肪間充質(zhì)干細(xì)逡逑胞中通過Ｗｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ技術(shù)從蛋白水平證實(shí)原桂酸具有抑制其破骨分化的作用。逡逑此外，本研宄過程中還發(fā)現(xiàn)原硅酸在作用ＡＤＭＳＣｓ后，ＣＴＳＫ的表達(dá)出現(xiàn)下調(diào)而逡逑Ｃ０Ｌ１的表達(dá)卻出現(xiàn)上調(diào)（圖４、８、１１），因ＣＴＳＫ具有降解Ｃ０Ｌ１的作用，，這表明逡逑原硅酸使ＣＴＳＫ表達(dá)下調(diào)或許是⑶Ｌ１表達(dá)上調(diào)的原因之一。逡逑總之，本研宄結(jié)果表明：原硅酸影響ＡＤＭＳＣｓ骨分化的機(jī)制，從促進(jìn)成骨分逡逑化和抑制破骨分化兩方面進(jìn)行。首先，原硅酸通過激活ＰＩ３Ｋ－Ａｋｔ－ｍＴ０Ｒ信號通路逡逑對ＡＤＭＳＣｓ成骨分化進(jìn)行正向調(diào)節(jié)；其次，原硅酸通過下調(diào)ＲＡＮＫＬ的表達(dá)和上調(diào)逡逑０ＰＧ的表達(dá)，并同時(shí)抑制ＲＡＮＫＬ的作用，抑制ＡＤＭＳＣｓ向破骨分化。此研宄結(jié)果逡逑將為探索原硅酸聯(lián)合脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞治療骨質(zhì)疏松癥提供體外研究的理論依逡逑據(jù)
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R580

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本文編號：2706665