【摘要】：目的:骨質(zhì)疏松癥(osteoporosis,OP)是一種多原因?qū)е鹿切纬墒軗p和(或)骨吸收過度有關(guān)的骨骼相關(guān)的疾病。褪黑素(Melatonin,MT)因為其具有促進成骨細胞分化的作用,臨床上已建議使用一定劑量的MT來治療OP。但是,關(guān)于MT對骨髓單核細胞(Bone marrow monocytes,BMMs)向破骨細胞(Osteoclast,OC)分化的直接作用仍然是未知的。我們這項研究的目的就是為了觀察生理或藥理學(xué)濃度的MT是否會對OC分化產(chǎn)生影響,及其分子機制。方法:從C57BL/6小鼠的脛骨和股骨上提取并分離出BMMs,并誘導(dǎo)BMMs向OC分化。然后在誘導(dǎo)分化過程中加入生理學(xué)濃度(0.01至10nM)或藥理學(xué)濃度(1至100μM)的MT,培養(yǎng)一定時間后,使用抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-resistant acid phosphatase,TRAP)染色來標(biāo)記TRAP陽性的OC數(shù)量,然后檢測OC特異性基因的表達水平,觀察不同濃度梯度的MT對OC分化的影響。從而進一步探究其潛在的機制,以及研究沉默信息調(diào)節(jié)因子1(Silent information regulator type 1,SIRT1)和活性氧(Reactive oxygen species,ROS)在OC分化的作用。結(jié)果:我們的研究發(fā)現(xiàn)藥理學(xué)濃度的MT能夠顯著抑制BMMs向OC分化,而且隨著MT濃度的增加,MT抑制破骨細胞分化的作用逐漸增強,同時發(fā)現(xiàn)生理學(xué)濃度的MT不能影響OC的分化。我們發(fā)現(xiàn)在藥理濃度的MT能夠顯著降低BMMs分化成TRAP陽性O(shè)C的數(shù)量和OC相關(guān)的特異性基因表達的標(biāo)志物數(shù)量。同時發(fā)現(xiàn)MT是通過阻斷活化B細胞核因子κ-輕鏈增強子(Nuclear factorκ-light-chain-enhancer of activated B cells,NF-κB)信號通路來抑制OC的分化。同時,我們發(fā)現(xiàn)MT抑制OC分化與SIRT1信號通路無關(guān)聯(lián),以及使用SIRT1抑制劑不能影響MT抑制OC分化的作用。但是,我們發(fā)現(xiàn)當(dāng)補充外源性過氧化氫(Hydrogen peroxide,H_2O_2)時,能夠部分的恢復(fù)MT抑制OC分化的作用。結(jié)論:藥理濃度的MT通過降低細胞內(nèi)的ROS顯著的抑制BMMs向OC分化。MT抑制破骨細胞分化的作用與SIRT1相關(guān)的信號通路無關(guān)聯(lián)。
【圖文】：

圖 1:（A）M-CSF 對 BMMs 增值情況的影響。細胞在加入 20ng/ml 的 M-CSF 和缺乏 M-CSF 的情況下進行細胞培養(yǎng)。在培養(yǎng)至 0 時、48 時和 96 時，我們觀察到對照組和 M-CSF 處理組均出現(xiàn)類似圓形的細胞形態(tài)。（B）通過 CCK-8 試劑盒測量后，我們發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)至 24 時、48 時、72 時和 96 時，空白對照組和 M-CSF 處理組中 BMMs

在 RANKL 處理組中破骨相關(guān)基因 TRAP（圖 2D）、CSTK（圖 2E）和 OSCAR（圖2F）的 mRNA 表達水平明顯升高。然而，在僅有 M-CSF 的處理組未見到破骨相關(guān)基因升高（圖 2E）。圖2：RANKL誘導(dǎo) BMMs 向OC 分化的作用。（A）免疫熒光結(jié)果觀察到與 M-CSF處理組相比 RANKL 處理組形成一個完整的肌動蛋白環(huán)。（B）定量結(jié)果顯示 RANKL處理組中肌動蛋白大小（圖 2B）。（C）OC 中總核的百分比。然后，使用實時 RT-PCR測量 TRAP（D）、CTSK（E）和 OSCAR（F）mRNA 的表達水平。四個獨立實驗數(shù)
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R580

【參考文獻】

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本文編號：2666540