【摘要】：研究背景:長期大量的高脂飲食(HFD)誘導(dǎo)的肥胖已經(jīng)成為了男性睪酮缺乏(TD)的主要原因之一,然而具體機(jī)制尚不明確。睪酮生物合成是一個(gè)復(fù)雜的多步驟過程,涉及多種中間物質(zhì)的轉(zhuǎn)化,發(fā)揮調(diào)控轉(zhuǎn)化作用的關(guān)鍵分子包括類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白(StAR)、膽固醇側(cè)鏈裂解酶(P450scc)及3β-羥化類固醇脫氫酶(3β-HSD)等。作為睪酮生物合成過程中第一個(gè)且起限速作用的關(guān)鍵分子,StAR協(xié)助膽固醇跨過線粒體雙層膜至線粒體基質(zhì)內(nèi)膜側(cè)。對(duì)于StAR功能的維持,線粒體功能的穩(wěn)態(tài)具有不可或缺的重要意義。而在維持線粒體功能穩(wěn)態(tài)的過程中,親環(huán)素D(CypD)起到了重要的調(diào)節(jié)作用。研究目的:本實(shí)驗(yàn)首先建立高脂飼料喂養(yǎng)小鼠模型,探索其對(duì)血清及睪丸內(nèi)睪酮水平、StAR和CypD表達(dá)水平以及線粒體的影響。然后結(jié)合CypD過表達(dá)及CypD基因全敲兩種小鼠模型,進(jìn)一步闡明CypD在高脂飲食誘導(dǎo)的StAR表達(dá)下調(diào)中的作用。研究方法:1.構(gòu)建高脂飼料(HFD)喂養(yǎng)的小鼠模型:隨機(jī)將普通飼料(ND)喂養(yǎng)至8周齡的C57BL/6小鼠分成兩組,一組繼續(xù)ND喂養(yǎng),另一組給予高脂飼料(HFD)喂養(yǎng),換成HFD后再喂養(yǎng)16周,期間每兩周記錄一次體重;于第16周結(jié)束時(shí),采用X射線檢測小鼠全身各部體脂分布,觀察小鼠體型、睪丸大小及附睪周圍脂肪量,使用生化儀檢測血脂譜水平,分別使用總睪酮(TT)及黃體生成素(LH)相對(duì)應(yīng)的酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)試劑盒檢測小鼠血清及睪丸組織內(nèi)相應(yīng)的性激素水平,采用油紅染色觀察睪丸組織脂質(zhì)沉積分布。2.在高脂喂養(yǎng)16周時(shí),采用了 RT-PCR技術(shù)檢測睪丸組織中StAR、P450scc及3β-HSD在HFD組和ND組之間mRNA表達(dá)水平的差異。3.應(yīng)用了 Western Blot技術(shù)及免疫熒光染色法(immunofluorescence,IF)進(jìn)一步檢測了 HFD對(duì)StAR蛋白表達(dá)水平的影響。4.應(yīng)用透射電子顯微鏡檢測了 HFD對(duì)睪丸間質(zhì)(Leydig)細(xì)胞線粒體產(chǎn)生的影響。5.高脂飼料喂養(yǎng)小鼠模型中,采用RT-PCR和Western Blot技術(shù)探究HFD對(duì)睪丸組織CypD mRNA和蛋白表達(dá)水平的影響。6.構(gòu)建CypD過表達(dá)小鼠模型:選取8周齡C57BL/6小鼠,每周通過尾靜脈注射1次含CypD DNA(ppif)的腺病毒(Ad-PPIF)或空載對(duì)照腺病毒(Ad-EGFP),共注射了 2周,分別使用了RT-PCR和Western Blot技術(shù)檢測小鼠睪丸內(nèi)CypD和StAR在mRNA和蛋白表達(dá)水平的變化。7.CypD基因全敲(Ppif-/-)小鼠模型的構(gòu)建:由Ppif-/-小鼠與C57BL/6野生型(Ppif+/+)小鼠雜交10代,產(chǎn)生雜合型(Ppif+/-)雌、雄小鼠,作為父、母本,然后通過雌雄小鼠(Ppif+/-)雜交,產(chǎn)生同窩對(duì)照的敲除型(Ppif-/-)和野生型(Ppif+/+)兩組小鼠。在小鼠8周齡時(shí),換用HFD喂養(yǎng)16周。采用Western Blot技術(shù)檢測小鼠睪丸內(nèi)CypD和StAR蛋白表達(dá)水平的變化。結(jié)果:1.構(gòu)建HFD喂養(yǎng)的小鼠模型成功:HFD組小鼠體重上升趨勢(shì)較ND組更加明顯;從高脂喂養(yǎng)第4周起,兩組體重差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。HFD組小鼠無論是整體還是會(huì)陰部體脂分布率均顯著高于ND組(p0.05)。HFD組小鼠較ND組小鼠體型明顯肥胖;HFD組小鼠睪丸體積稍小于ND組,而其附睪周圍脂肪含量明顯多于ND組。生化儀分析顯示,血脂譜中僅有甘油三酯(TG)濃度在兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;HFD組血清中的總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)以及高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)濃度均顯著高于ND組(p0.05)。ELISA結(jié)果顯示,雖然與ND組相比,HFD組的T和LH濃度均在數(shù)值上減小,但是兩種性激素在兩組間的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;HFD組睪丸組織內(nèi)的睪酮濃度低于ND組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。油紅染色結(jié)果顯示,與ND組相比,HFD組睪丸間質(zhì)組織中脂質(zhì)沉積明顯增多。2.在高脂喂養(yǎng)16周時(shí),RT-PCR檢測顯示,與ND組相比,HFD組StAR mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)(p0.05);P450sccmRNA水平在數(shù)值上表現(xiàn)為升高,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;3β-HSDmRNA水平表達(dá)量呈顯著增加(p0.05)。3.Western Blot及灰度分析結(jié)果表明,HFD組StAR相對(duì)于內(nèi)參蛋白actin的表達(dá)量比ND組明顯下調(diào)(p0.05)。免疫熒光染色結(jié)果顯示,HFD組代表StAR蛋白的綠色熒光比ND組少。4.透射電鏡結(jié)果顯示,與ND組相比,HFD組睪丸間質(zhì)Leydig細(xì)胞線粒體內(nèi)外膜間隙增大。5.HFD組中CypDmRNA和蛋白表達(dá)水平均顯著高于ND組(p0.05)。6.構(gòu)建CypD過表達(dá)小鼠模型:Ad-PPIF組小鼠CypD在mRNA和蛋白水平均顯著高于Ad-EGFP組(p0.05);而Ad-PPIF組StAR在mRNA和蛋白水平較Ad-EGFP組表達(dá)下調(diào),均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。7.Ppif-/-小鼠模型的構(gòu)建:Western Blot及灰度分析結(jié)果表明,與Ppif+/+ HFD組相比,Ppif-/-HFD組小鼠睪丸組織的CypD蛋白表達(dá)完全被抑制;StAR蛋白表達(dá)雖略有增加,但無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。結(jié)論及意義:高脂飲食可以通過激活CypD過表達(dá)引起線粒體功能紊亂,進(jìn)而參與了高脂飲食誘導(dǎo)的StAR表達(dá)下調(diào),該研究為治療高脂飲食誘導(dǎo)的睪酮缺乏提供了可能的新思路。此外,該研究闡述了長期大量高脂飲食與睪酮缺乏的聯(lián)系,引起人們對(duì)不健康飲食習(xí)慣的重視,提醒人們保持適度飲食。
【圖文】：

２．邋ＮＤ與ＨＦＤ組Ｃ５７ＢＬ／６小鼠體脂分布情況。Ａ．小鼠體脂分布率。ｎ＝４。數(shù)值由均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差來表示。＊ｐ＜０．０５由Ｓｔｕｄｅｎｔ＇ｓｔ檢驗(yàn)得出。Ｂ．小鼠體睪丸及附睪周圍脂肪的照片。逡逑．高脂飼料喂養(yǎng)導(dǎo)致小鼠高脂血癥逡逑高脂飼料喂養(yǎng)小鼠至１６周時(shí)，眼球取血，生化儀分析血脂水平。結(jié)果顯組小鼠血清中ＴＧ的濃度為（０．６２±０．２０）ｍｍｏｌ／Ｌ，ＴＣ的濃度為（２．０丨±０．丨ｏｌ／Ｌ，邋ＬＤＬ邋的濃度為（０．２１±０．０６）邋ｍｍｏｌ／Ｌ，邋ＨＤＬ－Ｃ邋的濃度為（１．９３±０．２１ｏｌ／Ｌ；邋ＨＦＤ邋組邋ＴＧ邋的濃度為（０．６８±０．丨２）邋ｍｍｏｌ／Ｌ，邋ＴＣ邋的濃度為（３．９３±１．０５ｏｌ／Ｌ，ＬＤＬ－Ｃ邋的濃度為（０．４４±０．１１）邋ｍｍｏｌ／Ｌ，邋ＨＤＬ－Ｃ邋的濃度為（２．９０±１．０２ｏｌ／Ｌ。ＨＦＤ組血清ＴＣ、ＬＤＬ－Ｃ以及ＨＤＬ－Ｃ濃度均高于ＮＤ組，且差異均顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（；７＜邋０．０５）；僅有ＴＧ濃度在兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。逡逑６邐ｍ邋ＮＤ邐口邋ＨＦＤ逡逑

ｔ？－邐ＮＤ邐ＨＦＤ邐ＮＤ邋ＨＦＤ逡逑Ｗ體邐公Ｗｌ部逡逑與ＨＦＤ組Ｃ５７ＢＬ／６小鼠體脂分布情況。Ａ．小鼠體脂分布率。ｎ＝４。均數(shù)士標(biāo)準(zhǔn)差來表示。＊ｐ＜０．０５由Ｓｔｕｄｅｎｔ＇ｓｔ檢驗(yàn)得出。Ｂ．小鼠體睪丸及附睪周圍脂肪的照片。逡逑飼料喂養(yǎng)導(dǎo)致小鼠高脂血癥逡逑飼料喂養(yǎng)小鼠至１６周時(shí)，眼球取血，生化儀分析血脂水平。結(jié)果顯鼠血清中ＴＧ的濃度為（０．６２±０．２０）ｍｍｏｌ／Ｌ，，ＴＣ的濃度為（２．０丨±０．，邋ＬＤＬ邋的濃度為（０．２１±０．０６）邋ｍｍｏｌ／Ｌ，邋ＨＤＬ－Ｃ邋的濃度為（１．９３±０．；邋ＨＦＤ邋組邋ＴＧ邋的濃度為（０．６８±０．丨２）邋ｍｍｏｌ／Ｌ，邋ＴＣ邋的濃度為（３．９３±１．，ＬＤＬ－Ｃ邋的濃度為（０．４４±０．１１）邋ｍｍｏｌ／Ｌ，邋ＨＤＬ－Ｃ邋的濃度為（２．９０±１．。ＨＦＤ組血清ＴＣ、ＬＤＬ－Ｃ以及ＨＤＬ－Ｃ濃度均高于ＮＤ組，且差異統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（；７＜邋０．０５）；僅有ＴＧ濃度在兩組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。逡逑６邐ｍ邋ＮＤ邐口邋ＨＦＤ逡逑
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R589.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2666206