發(fā)布時間：2020-04-23 11:03

【摘要】：目的體外分離培養(yǎng)大鼠脂肪干細胞(Adipose derived stem cells,ASCs),制備脂肪干細胞來源的條件培養(yǎng)基(Adipose derived stem cells conditioned medium,ASCs-CM),探討ASCs-CM對皮膚成纖維細胞的增殖、遷移及向肌成纖維細胞分化功能的影響。另外,通過體內動物實驗觀察ASCs-CM對糖尿病大鼠皮膚創(chuàng)面愈合的影響。方法取健康SD大鼠脂肪組織,采用酶消化法分離培養(yǎng)ASCs,通過細胞免疫熒光染色法鑒定脂肪干細胞。收集第5代ASCs的條件培養(yǎng)基,用超濾離心管進行濃縮,獲得ASCs-CM。將成纖維細胞分為ASCs-CM組與低糖培養(yǎng)基組,分別記為處理組(ASCs-CM)和對照組(N-CM)。通過CCK-8實驗和劃痕實驗觀察ASCs-CM對成纖維細胞增殖和遷移功能的影響;通過Western Blot實驗和實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測ASCs-CM對成纖維細胞向肌成纖維細胞分化功能的影響。用鏈脲佐菌素誘導糖尿病SD大鼠模型,成模后將大鼠隨機分為ASCs-CM組和N-CM組,并制備糖尿病大鼠全層皮膚創(chuàng)面模型,在創(chuàng)面周圍分別注射ASCs-CM或N-CM 0.5mL。分別在術后第4、8、12和16天測量殘余創(chuàng)面面積,并取部分創(chuàng)面組織分別進行免疫組織化學染色和qRT-PCR檢測α-SMA與TGF-β1的表達。結果本實驗成功分離脂肪干細胞,通過免疫熒光鑒定,符合脂肪干細胞的特性。CCK-8實驗和細胞劃痕實驗結果顯示,ASCs-CM能顯著促進成纖維細胞的增殖與遷移。同時,Western blot和qRT-PCR實驗均驗證了ASCs-CM能促進成纖維細胞向肌成纖維細胞分化,差異有統(tǒng)計學意義。動物實驗顯示,ASCs-CM組在術后的第4、8、12和16天的創(chuàng)面愈合率均顯著高于N-CM組,差異統(tǒng)計學意義。免疫組織化學染色和qRT-PCR結果顯示,在術后的第4天,ASCs-CM組的α-SMA表達高于N-CM組(P0.05);在術后的第4、8和12天,TGF-β1的表達量顯著高于對照組,差異有統(tǒng)計學意義。結論本課題研究證明脂肪干細胞條件培養(yǎng)基可能通過促進創(chuàng)面中TGF-β1的分泌以及促進成纖維細胞的增殖、遷移與分化從而加速了糖尿病SD大鼠的創(chuàng)面愈合。
【圖文】：

PCR擴增程序

顯微鏡下觀察第三代脂肪干細胞形態(tài)
【學位授予單位】：錦州醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R587.2

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本文編號：2637661