【摘要】：目的 摸索ERK-MAPK通路抑制劑PD98059最佳濃度和作用時(shí)間,探討ERKMAPK信號(hào)通路在氟致原代培養(yǎng)海馬神經(jīng)元突觸可塑性損傷中的調(diào)控作用,探討氟暴露損傷海馬神經(jīng)元突觸可塑性的分子機(jī)制,為揭示氟暴露損害學(xué)習(xí)記憶的分子機(jī)制提供理論依據(jù)。方法 抑制劑PD98059最佳濃度和作用時(shí)間的摸索:取新生24h內(nèi)的SPF級(jí)SD大鼠仔鼠海馬組織進(jìn)行體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元,培養(yǎng)成熟的海馬神經(jīng)元分別暴露于抑制劑終濃度為0.0(空白對(duì)照)、5、10、25、50、100μmol/L的培養(yǎng)基中24h;抑制劑最佳濃度的培養(yǎng)基中0、3、6、12、24、48h。CCK-8法檢測(cè)海馬神經(jīng)元存活率;乳酸脫氫酶(LDH)試劑盒測(cè)定海馬神經(jīng)元培養(yǎng)上清液中LDH活力;RTqPCR法檢測(cè)細(xì)胞中ERK、CREB mRNA的表達(dá)水平;Western-blot法檢測(cè)細(xì)胞中ERK、p-ERK1/2、CREB、p-CREB蛋白表達(dá)水平。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析,得出最佳抑制劑濃度和作用時(shí)間。ERK-MAPK通路的調(diào)控作用:課題組前期實(shí)驗(yàn)得出最佳氟處理濃度和作用時(shí)間分別為0.8μg/ml、24h。細(xì)胞分四組:空白對(duì)照組、0.8μg/ml氟處理組,25μmol/L抑制劑組、25μmol/L抑制劑+0.8μg/ml氟處理組,分別處理24h。光學(xué)倒置顯微鏡觀察海馬神經(jīng)元突起數(shù)量;CCK-8法檢測(cè)海馬神經(jīng)元細(xì)胞存活率;激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平;RT-qPCR法測(cè)定細(xì)胞中ERK1/2、CREB、BDNF、突觸相關(guān)蛋白突觸素(SYN)、生長(zhǎng)相關(guān)蛋白43(GAP-43)、突觸后致密蛋白95(PSD-95)的mRNA表達(dá)水平;Western-blot法測(cè)定細(xì)胞中ERK、p-ERK1/2、CREB、p-CREB、磷酸化鈣調(diào)激酶Ⅱ(pCaMKⅡ)、BDNF、SYN、GAP-43蛋白表達(dá)水平。結(jié)果 1細(xì)胞存活率在不同抑制劑處理組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),50、100μmol/L組細(xì)胞存活率低于空白對(duì)照、5、10、25μmol/L組(P0.05),24h、48h組細(xì)胞存活率低于0h、3h、6h、12h組(P0.05)。2海馬神經(jīng)元培養(yǎng)上清液LDH活力在不同抑制劑組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),25、50、100μmol/L組海馬神經(jīng)元LDH活力高于空白對(duì)照、5、10μmol/L組(P0.05),12h、24h、48h組海馬神經(jīng)元LDH活力高于0h、3h、6h組(P0.05)。3 ERK1/2、CREB mRNA表達(dá)水平在不同抑制劑組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),25、50、100μmol/L組ERK1/2、CREB mRNA表達(dá)水平低于空白對(duì)照、5、10μmol/L組(P0.05),12h、24h、48h組ERK1/2、CREB mRNA表達(dá)水平低于0h、3h、6h組(P0.05)。4 p-ERK1/2、p-CREB蛋白表達(dá)水平在不同抑制劑組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),25、50、100μmol/L組p-ERK1/2、p-CREB蛋白表達(dá)水平低于空白對(duì)照、5、10μmol/L組(P0.05),12h、24h、48h組p-ERK1/2、p-CREB蛋白表達(dá)水平低于0h、3h、6h組(P0.05)。綜上得出:抑制劑最佳濃度和作用時(shí)間分別為25μmol/L、24h。5細(xì)胞存活率在不同處理方法組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),0.8mg/L氟處理組、抑制劑+氟處理組細(xì)胞存活率低于對(duì)照組(P0.05),抑制劑+氟處理組細(xì)胞存活率高于0.8mg/L氟處理組(P0.05)。6與對(duì)照組比較,0.8mg/L氟處理組、抑制劑+氟處理組海馬神經(jīng)元鈣離子熒光強(qiáng)度和pCaMKⅡ蛋白表達(dá)水平均升高(P0.05);與0.8mg/L氟處理組比較,抑制劑+氟處理組鈣離子熒光強(qiáng)度和pCaMKⅡ蛋白表達(dá)水平降低(P0.05)。7與對(duì)照組比較,0.8mg/L氟處理組、25μmol/L抑制劑處理組、抑制劑+氟處理組ERK1/2、CREB mRNA表達(dá)水平降低(P0.05);與氟處理組比較,抑制劑+氟處理組ERK1/2、CREB mRNA表達(dá)水平降低(P0.05);0.8mg/L氟處理組、抑制劑+氟處理組SYN、GAP-43、PSD-95、BDNF mRNA表達(dá)水平低于對(duì)照組(P0.05),抑制劑+氟處理組SYN、GAP-43、PSD-95、BDNF mRNA表達(dá)水平高于0.8mg/L氟處理組(P0.05)。8 p-ERK1/2、p-CREB、BDNF、SYN、GAP-43蛋白表達(dá)水平在不同處理方法組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。0.8mg/L氟處理組、25μmol/L抑制劑處理組、抑制劑+氟處理組p-ERK1/2、p-CREB蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組(P0.05),抑制劑+氟處理組pERK1/2、p-CREB蛋白表達(dá)水平低于0.8mg/L氟處理組(P0.05);0.8mg/L氟處理組、抑制劑+氟處理組SYN、GAP-43、BDNF蛋白表達(dá)水平低于對(duì)照組(P0.05),25μmol/L抑制劑處理組、抑制劑+氟處理組SYN、GAP-43、BDNF蛋白表達(dá)水平高于氟處理組(P0.05)。結(jié)論 1 MEK抑制劑PD98059能減緩氟對(duì)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元突觸可塑性損傷作用。2 ERK-MAPK通路能正向調(diào)控氟對(duì)體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元突觸可塑性損傷作用。
【圖文】：

用（ x± s）表示，采用 SPSS17.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)因素方差分析，多組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)，組用 SNK 檢驗(yàn)（Student-Newman-Keuls）；若方差不驗(yàn)；檢驗(yàn)水準(zhǔn) α=0.05。代海馬神經(jīng)元的純度鑒定光法做純度鑒定，海馬神經(jīng)元的樹(shù)突在 MAP2 作用胞核在 Hoechst33258 的作用下染成藍(lán)色熒光，最后占 Hoechst33258 所染總細(xì)胞數(shù)的比例，即為海馬神下進(jìn)行觀察，從中隨機(jī)選取 20 個(gè)視野，分別對(duì)每進(jìn)行計(jì)數(shù)，得出陽(yáng)性細(xì)胞占比 94.3%，，能達(dá)到實(shí)驗(yàn)

a：體外培養(yǎng)第一天；b：體外培養(yǎng)第二天；c:體外培養(yǎng)第三天；d：體外培養(yǎng)第四天；e：體外培養(yǎng)第五天；體外培養(yǎng)第六天；g：體外培養(yǎng)第七天。圖 2 體外培養(yǎng)原代海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察（×100）Fig. 2 Morphology observation of primary hippocampal neurons cultured in vitro（×100）
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R595

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2592446