【摘要】：系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)是以產(chǎn)生多種自身抗體,全身多系統(tǒng)、多器官受累為特征的自身免疫性疾病,狼瘡樣腎病(lupus nephritis,LN)是該疾病最嚴(yán)重的并發(fā)癥。目前,該疾病的發(fā)病機(jī)制尚無明確定論,可能與環(huán)境、遺傳等多種因素有關(guān)。B7-2分子是表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)表面重要的共刺激分子,B7-2分子通過與T細(xì)胞表面的CD28分子結(jié)合,可產(chǎn)生促進(jìn)T細(xì)胞活化、增殖、分化以及發(fā)揮免疫效應(yīng)所必需的共刺激信號。此信號的缺乏可導(dǎo)致T細(xì)胞進(jìn)入無反應(yīng)狀態(tài)(Anergy)或者免疫耐受(Tolerance),甚至引起細(xì)胞程序性死亡(Apoptosis)。研究表明,B7-CD28共刺激信號通路在SLE的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。因此,應(yīng)用特異性B7抗體阻斷或削弱該信號通路,可抑制自身免疫應(yīng)答,減輕SLE的病理損傷,為治療此類疾病提供了高效、特異的生物治療方法。傳統(tǒng)鼠源性抗體因其免疫原性,應(yīng)用于人體易產(chǎn)生人鼠抗體反應(yīng)(Human anti-mouse antibody,HAMA),影響治療效果。采用基因工程技術(shù)設(shè)計(jì)出的人鼠嵌合抗體,保留了鼠源抗體特異性和親和力,大大降低抗體免疫原性,避免HAMA反應(yīng),同時(shí)具有介導(dǎo)ADCC效應(yīng)、CDC效應(yīng)及免疫調(diào)理作用。本課題通過建立與人類SLE疾病類似的慢性移植物抗宿主病(c GVHD)小鼠狼瘡樣腎病模型,應(yīng)用自行研制的人鼠嵌合B7-2抗體對該疾病模型進(jìn)行干預(yù),進(jìn)而從免疫學(xué)、血清學(xué)及腎臟組織形態(tài)學(xué)等方面觀察抗體對疾病模型病理損傷的逆轉(zhuǎn)效應(yīng)及其分子機(jī)制。一、人鼠嵌合B7-2抗體制備及鑒定目的:制備人鼠嵌合B7-2抗體并鑒定其生物學(xué)活性。方法:復(fù)蘇本科室保存的穩(wěn)定分泌人鼠嵌合B7-2抗體的細(xì)胞株4F4,采用細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)、超濾濃縮及免疫親和層析等技術(shù)制備人鼠嵌合B7-2抗體;流式細(xì)胞術(shù)分析人鼠嵌合B7-2抗體對不同細(xì)胞膜型B7-2分子的識別。結(jié)果:4F4細(xì)胞培養(yǎng)上清中的抗體得率約為4mg/L,人鼠嵌合B7-2抗體與L929-B7-2、Daudi以及小鼠脾臟細(xì)胞的陽性結(jié)合率分別為99.0%,93.7%和63.0%。結(jié)論:人鼠嵌合B7-2抗體能夠特異性識別不同細(xì)胞膜型B7-2分子。二、慢性移植物抗宿主病小鼠狼瘡樣腎病模型的建立及生物學(xué)鑒定目的:構(gòu)建慢性移植物抗宿主病(c GVHD)小鼠狼瘡樣腎病模型并對其進(jìn)行生物學(xué)鑒定。方法:將20只6~8周齡雌性(C57BL/J6×BALB/c)F1雌鼠隨機(jī)分成兩組,造模組小鼠于0、3、7和11d經(jīng)尾靜脈注射親代雌性BALB/c小鼠脾臟細(xì)胞,107/100μL/只。對照組應(yīng)用同體積生理鹽水處理。末次注射后第七天,流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾臟中抗原遞呈細(xì)胞(MHC-II+)與抗體產(chǎn)生相關(guān)細(xì)胞(B220+)的活化程度;每2周定期檢測血清中抗雙鏈ds DNA抗體、ANA的含量;每月定期采集晨尿檢測尿蛋白含量。3個(gè)月后處死小鼠,經(jīng)HE染色觀察腎臟病理變化,直接免疫熒光法分析免疫復(fù)合物(IC)的沉積,透射電鏡觀察腎小球超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果:造模組小鼠脾臟中抗原遞呈細(xì)胞(MHC-II+)與抗體產(chǎn)生相關(guān)細(xì)胞(B220+)的活化程度明顯增強(qiáng)(p0.05);建模第2周,造模組80%的小鼠血清中可檢測到抗ds DNA抗體和ANA,第4周時(shí)達(dá)到90%;建模3個(gè)月,造模組80%的小鼠可檢測出蛋白尿,蛋白含量為++~++++;HE染色觀察顯示,造模組小鼠出現(xiàn)腎小球腫脹及炎性細(xì)胞浸潤;直接免疫熒光法顯示,造模組小鼠腎小球部位有大量IC沉積;造模組小鼠透射電鏡下可見腎小球致密物沉積、基底膜節(jié)段性增厚等病理改變。結(jié)論:慢性移植物抗宿主病小鼠狼瘡樣腎病模型構(gòu)建成功。三、人鼠嵌合B7-2抗體對小鼠狼瘡樣腎病模型的免疫干預(yù)效應(yīng)及分子機(jī)制的研究目的:探討人鼠嵌合B7-2抗體通過阻斷B7/CD28信號通路對小鼠狼瘡樣腎病模型的免疫干預(yù)效應(yīng)及其分子機(jī)制。方法:按上述建模方法,將40只F1代雌鼠隨機(jī)分為4組,即造模組、抗體干預(yù)組、CTX組及對照組。末次淋巴細(xì)胞注射后,干預(yù)組小鼠于第1、3、5、8及15天經(jīng)尾靜脈注射人鼠嵌合B7-2抗體,200μg/只,之后每隔1個(gè)月注射一次,連續(xù)注射3個(gè)月;CTX組于第1、2天腹腔注射CTX2.5mg/只。流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾臟中抗原遞呈細(xì)胞(MHC-II+)與抗體產(chǎn)生相關(guān)細(xì)胞(B220+)的活化程度;每2周定期檢測血清中抗雙鏈ds DNA抗體、ANA的含量;每月定期采集晨尿檢測尿蛋白含量。3個(gè)月后處死小鼠,經(jīng)HE染色觀察腎臟病理變化,直接免疫熒光法分析免疫復(fù)合物(IC)的沉積,透射電鏡觀察腎小球超微結(jié)構(gòu)的改變。結(jié)果:免疫熒光及流式細(xì)胞術(shù)分析結(jié)果顯示,抗體干預(yù)組小鼠脾臟中抗原遞呈細(xì)胞(MHC-II+)與抗體產(chǎn)生相關(guān)細(xì)胞(B220+)的活化程度明顯低于造模組(p0.05);造模第4周時(shí),造模組90%的小鼠血清能檢測到抗ds DNA抗體和ANA的表達(dá),而抗體干預(yù)組的檢出率僅為30%,且抗體滴度明顯低于造模組;造模第3個(gè)月時(shí)70%的造模組小鼠出現(xiàn)蛋白尿,蛋白含量為++~++++,抗體干預(yù)組僅有20%,且蛋白含量為+~++;HE染色觀察顯示,造模組腎臟組織出現(xiàn)腎小球腫脹,炎性細(xì)胞浸潤等癥狀,抗體干預(yù)組小鼠腎小球體積輕微增大,周圍少許炎性細(xì)胞浸潤,小鼠腎臟病理學(xué)改變明顯輕于造模組;直接免疫熒光法發(fā)現(xiàn)造模組小鼠腎小球部位有大量IC沉積,抗體干預(yù)組的腎小球輪廓較清晰,IC的沉積明顯少于造模組;通過透射電鏡對超微結(jié)構(gòu)的觀察,發(fā)現(xiàn)造模組出現(xiàn)致密物沉積、基底膜節(jié)段性增厚等病理改變,抗體干預(yù)組未出現(xiàn)明顯病理改變。CTX組小鼠上述指標(biāo)與抗體干預(yù)組均無明顯差別。結(jié)論:人鼠嵌合B7-2抗體通過削弱或者封閉B7-CD28信號通路,可抑制機(jī)體免疫細(xì)胞異�；罨�,逆轉(zhuǎn)狼瘡樣腎病病理損傷,提示該類特異性抗體對防治SLE或c GVHD等疾病具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
【圖文】：

L929-mock L929-B7-2Daudi Spleen cells圖1 人鼠嵌合B7-2抗體對不同細(xì)胞膜型B7-2分子的識別討 論目的蛋白的產(chǎn)量一直是嵌合抗體制備過程中的難點(diǎn)。已有研究表明，在一定的雜交瘤細(xì)胞密度下，目的蛋白的產(chǎn)量與細(xì)胞生長的速率呈正相關(guān)，當(dāng)雜交瘤細(xì)胞密度過大時(shí)，目的蛋白的產(chǎn)量反而降低。因此，當(dāng)細(xì)胞增殖到高密度時(shí)，采用一定手段抑制細(xì)胞的進(jìn)一步增殖，，細(xì)胞的代謝卻并未停止，仍在持續(xù)分泌表達(dá)目的蛋白。鑒于此，本研究在 4F4 細(xì)胞株生長到合適密度時(shí)（即細(xì)胞鋪滿細(xì)胞瓶底80%~90%），將培養(yǎng)基更換為無血清的基礎(chǔ)培養(yǎng)基，使得細(xì)胞的增殖速度減慢，但是抗體仍在持續(xù)分泌。這樣不僅避免了完全培養(yǎng)基影響抗體的純度，也大大減少了抗體純化時(shí)雜蛋白的量。隨后采用 Protein G 親和層析柱對嵌合抗體進(jìn)行純化

實(shí)驗(yàn)4周時(shí)血清中抗dsDNA抗體表達(dá)(X400
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R593.241

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2579277