【摘要】：研究背景和目的:糖尿病是由于體內(nèi)胰島素分泌失衡或外周組織對胰島素抵抗導(dǎo)致胰島素絕對或相對不足,導(dǎo)致的機(jī)體血糖持續(xù)升高,進(jìn)而繼發(fā)多組織器官損傷。CDC42是一個Rho家族GTPases的成員,有研究表明其具有調(diào)控胰島素分泌的作用。本課題旨在利用胰島β細(xì)胞特異性敲除CDC42小鼠模型進(jìn)一步確定CDC42在葡萄糖刺激誘導(dǎo)胰島素分泌(GSIS)過程中的可能分子信號通路,從而為闡明CDC42在胰島β細(xì)胞分泌胰島素中的作用及其機(jī)制提供實驗依據(jù)。方法:1.利用生物信息學(xué)數(shù)據(jù)庫分析CDC42在小鼠主要器官和不同年齡時胰腺中的表達(dá)情況;2.制備胰島β細(xì)胞特異性敲除CDC42小鼠,PCR鑒定小鼠基因型并分離胰島細(xì)胞Western blot分析小鼠是否構(gòu)建成功;3.分離小鼠的胰島以及制備抑制CDC42活性的MIN6細(xì)胞模型,分別檢測β細(xì)胞在低糖、高糖、KCl刺激后胰島素的分泌量并檢測胰島素基因的表達(dá)情況;4.利用免疫熒光技術(shù),在熒光顯微鏡觀察CDC42和胰島素在不同條件刺激后的亞細(xì)胞分布,探討β細(xì)胞結(jié)構(gòu)功能的變化情況;5.機(jī)制分析:β細(xì)胞負(fù)載鈣離子探針(Fluo-3 AM),實時監(jiān)測細(xì)胞在不同條件刺激下胞內(nèi)鈣的動態(tài)變化;Q-PCR分析鈣調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白(NCX,SERCA,IP3R等)mRNA水平上的表達(dá)情況;Western blot檢測相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子,進(jìn)一步確定CDC42通過調(diào)控胞內(nèi)鈣參與GSIS的作用機(jī)制。結(jié)果:1.CDC42在小鼠內(nèi)分泌系統(tǒng)和神經(jīng)系統(tǒng)的組織中表達(dá)量較高,在胰腺中有一定的表達(dá),且在胚胎14天左右,CDC42在胰腺組織表達(dá)明顯增加,在出生前達(dá)表達(dá)高峰,從出生至成年CDC42表達(dá)量維持一定的豐度;2.基因型鑒定和Western blot確定小鼠基因型,結(jié)果顯示胰島β細(xì)胞特異性敲除CDC42小鼠,其胰島中的CDC42表達(dá)量顯著下調(diào)80%;3.胰島β細(xì)胞特異性敲除CDC42的胰島β細(xì)胞下調(diào)GSIS中胰島素的分泌,抑制CDC42活性同樣導(dǎo)致MIN6細(xì)胞胰島素分泌量減少;4.在MIN6細(xì)胞系中抑制CDC42活性導(dǎo)致胰島素顆粒在胞膜附近大量積聚,MIN6細(xì)胞出現(xiàn)分泌功能障礙的表型;5.在β細(xì)胞中敲除CDC42或在MIN6細(xì)胞中抑制CDC42活性都減弱GSIS中[Ca2+]c的上調(diào),且Q-PCR結(jié)果顯示Calmodulin、Calcineurin和IP3R基因等鈣調(diào)相關(guān)基因表達(dá)改變;同時敲除CDC42小鼠胰島組織中Foxa2表達(dá)明顯下調(diào)。結(jié)論:敲除胰島β細(xì)胞CDC42基因或者抑制MIN6細(xì)胞的CDC42活性,均可導(dǎo)致胰島素顆粒胞吐受阻,胰島素分泌減少,其機(jī)制可能與CDC42缺失所致細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)失衡密切相關(guān)。此外,敲除CDC42所致的Foxa2表達(dá)下調(diào),也可能參與了β細(xì)胞胰島素的分泌調(diào)節(jié)。綜上所述,我們的研究在體內(nèi)和體外證明CDC42是β細(xì)胞葡萄糖刺激誘導(dǎo)的胰島素分泌機(jī)制中重要的調(diào)節(jié)因子。
【圖文】：

研究背景糖尿病是由于胰島β 細(xì)胞胰島素分泌不足或外周組織胰島素抗性增加血糖升高，繼而引起多器官功能障礙的多基因疾病。在過去十年中，隨式的改變，全世界的糖尿病患者急劇增加，已經(jīng)有超過 3.8 億患者，世織估計，到 2030 年這一數(shù)量將增加一倍以上。中國是糖尿病患者極劇之一（圖 1.1），患者約占我國人口的十分之一[1, 2]。胰島素是機(jī)體內(nèi)唯低血糖，同時促進(jìn)細(xì)胞中糖原、脂肪、蛋白質(zhì)合成的蛋白類激素；是調(diào)糖代謝，脂肪代謝和生長、發(fā)育和衰老的必需元素。機(jī)體內(nèi) 99%的胰島胰島β 細(xì)胞。然而，，當(dāng)胰島素分泌減少甚至沒有胰島素，或者身體對胰抵抗時，就可能引發(fā)機(jī)體血糖升高，發(fā)生糖尿病。同時，糖尿病也是造腎衰竭、截肢、心力衰竭和中風(fēng)的主要原因。糖尿病主要分為 I 型糖尿尿病，當(dāng)然也有其他類型，比如說妊娠期發(fā)生的妊娠糖尿病等[2, 3]。

大多數(shù)細(xì)胞中，胞內(nèi)鈣離子主要有兩個離子交換系統(tǒng)：質(zhì)膜上a+/Ca2+exchanger, NCX）和質(zhì)膜鈣 ATP 酶(plasma membrane A)（圖 1.2）。這兩個系統(tǒng)相互補(bǔ)充，其中 NCX 的泵出能力強(qiáng)但（它耦合 3 個 Na+交換 1 個 Ca2+），因而它是帶電荷的并受膜看到 NCX1 失活反而是有利于胰島素的分泌[22]。PMCA 則相 Ca2+便會耦合大于 1 個或 2 個 H+，使得離子泵呈中性，因此維持靜息狀態(tài)的鈣平衡[23-25]。同時在細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)具有強(qiáng)大力，作為細(xì)胞內(nèi)主要的鈣庫，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)能有效的緩沖細(xì)胞內(nèi)的 ATP 酶（sarco endoplasmic reticulum Calcium adenosine，SE庫的功能中發(fā)揮決定性作用，SERCA 主要幫助內(nèi)質(zhì)網(wǎng)攝取和子，當(dāng)抑制 SERCA 后，鈣離子迅速的泵出，這說明細(xì)胞消耗換 ER 釋放的 Ca2+，不過其具體的交換機(jī)制仍不清楚。最近幾類型提出了幾種鈣離子調(diào)節(jié)候選蛋白：1,4.5 三磷酸肌醇受體（osphate receptor,IP3R），丙氨醛受體（theryanodine receptor，R體家族（transient receptor potential，TRP）成員（比如 Bcl-2，B
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 Ambady Ramachandran;Chamukuttan Snehalatha;Ananth Samith Shetty;Arun Nanditha;;Trends in prevalence of diabetes in Asian countries[J];World Journal of Diabetes;2012年06期

本文編號：2570103