【摘要】：研究背景： 類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種對稱性多關(guān)節(jié)炎為主要臨床表現(xiàn)的自身免疫性疾病,發(fā)病機(jī)制涉及抗原遞呈細(xì)胞、T細(xì)胞、B細(xì)胞、滑膜成纖維細(xì)胞及細(xì)胞因子,在疾病發(fā)展過程中滑膜增殖形成血管翳,造成軟骨和骨的侵蝕破壞,最后導(dǎo)致關(guān)節(jié)強(qiáng)直、畸形、功能喪失和不同程度的殘廢。 樹突狀細(xì)胞(dendritic cell, DC)是公認(rèn)的功能最強(qiáng)大的專職性抗原提呈細(xì)胞,在誘導(dǎo)免疫反應(yīng)及免疫耐受形成中起重要作用。耐受性DC (tolerogenic dendritic cells, tDCs)具有誘導(dǎo)T細(xì)胞耐受從而抑制自身免疫反應(yīng)的作用；誘導(dǎo)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)增殖和分化；分泌高劑量的IL-4、IL-10,一方面可以使Thl細(xì)胞產(chǎn)生IFN-a,從而抑制炎癥反應(yīng),另一方面,高劑量IL-10也減少DC表面MHC-II分子、共刺激分子和黏附分子表達(dá),不能為T細(xì)胞提供相應(yīng)的刺激信號。目前僅有一些初步研究探討了tDC在類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎中的作用,而如何獲得安全有效的耐受性DC成為研究的關(guān)鍵。 血管活性腸肽(VIP)是潛在的免疫抑制劑,可以影響固有免疫和獲得性免疫,VIP治療膠原誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎,能減少致炎因子產(chǎn)生,增加抑炎因子水平,減輕關(guān)節(jié)炎癥和骨侵蝕。VIP作用機(jī)理是通過與巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞表面的受體(VPAC1)結(jié)合,誘導(dǎo)細(xì)胞鈍化,而VPAC1是樹突狀細(xì)胞的主要功能受體,因此有研究采用VIP誘導(dǎo)培養(yǎng)tDC,發(fā)現(xiàn)VIP誘導(dǎo)培養(yǎng)的人類耐受性DCs可上調(diào)CD4及CD8調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞),而后者可通過下調(diào)Th1細(xì)胞的活性和歸巢來緩解炎癥性疾病的病程,證實(shí)了VIP-tDCs的免疫耐受作用。tDC要作為治療細(xì)胞回輸體內(nèi),必須保證低或無免疫原性,然而,Heusch等研究發(fā)現(xiàn)作為治療性tDC一旦進(jìn)入宿主體內(nèi)可能會誘導(dǎo)產(chǎn)生免疫源性而非免疫耐受,因而獲得低免疫源性的tDCs成為tDC治療的另一關(guān)鍵,如采用低劑量GM-CSF培養(yǎng)液、加入抑炎因子如IL-4、IL-10等方法。而更直接獲得tDCs的方法則是通過抑制DC成熟過程中的信號傳導(dǎo)途徑來實(shí)現(xiàn),其中核因子κB (NFκB)是參與其成熟的重要的核轉(zhuǎn)錄因子,Zanetti等在體內(nèi)試驗(yàn)證實(shí)了NFκB在DCs成熟中的重要性,從敲除NFκB的RelB基因大鼠獲得的tDCs免疫大鼠,結(jié)果顯示其抗原特異性呈低反應(yīng)性,說明了通過阻斷NFκB途徑獲得tDC的可行性,并可有效降低其免疫原性反應(yīng)。此外,Popov等報道應(yīng)用NF-κB拮抗劑(LF15-0195)誘導(dǎo)培養(yǎng)耐受性DCs,不僅成功獲得了具有未成熟DCs細(xì)胞表型的tDCs,免疫實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎大鼠也觀察了初步的臨床緩解,并抑制了抗原特異性T淋巴細(xì)胞反應(yīng)。因此,通過干預(yù)DCs成熟過程中的不同環(huán)節(jié)及改變不同細(xì)胞因子誘導(dǎo)培養(yǎng)條件,可能獲得具有低免疫原性并能誘導(dǎo)抗原特異性免疫耐受的tDCs,并應(yīng)用于實(shí)驗(yàn)性關(guān)節(jié)炎的干預(yù)治療,從而為進(jìn)一步揭示RA發(fā)病機(jī)制,尋找免疫干預(yù)的不同位點(diǎn)和方法具有重要的意義。 本研究用不同方法誘導(dǎo)培養(yǎng)tDCs,尋找合適的作為耐受性DC培養(yǎng)條件,同時將VIP誘導(dǎo)培養(yǎng)的具有高效免疫耐受活性的tDC與阻斷NFκB途徑獲得的非成熟DC的低免疫源性相比較,從而獲得具有免疫調(diào)節(jié)作用的高效耐受性DCs,鑒定其細(xì)胞表型、分泌的細(xì)胞因子,用獲得的耐受性DC干預(yù)膠原誘導(dǎo)的實(shí)驗(yàn)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎小鼠,評估治療效果,并探討tDC可能的作用機(jī)制。 研究目的： 1、探索合適的VIP、Bay11-7082誘導(dǎo)耐受性樹突狀細(xì)胞(tDCs)的體系,并鑒定誘導(dǎo)的耐受性樹突狀細(xì)胞表面分子標(biāo)志、及其所分泌的細(xì)胞因子； 2、驗(yàn)證不同誘導(dǎo)方法誘導(dǎo)的耐受性DCs進(jìn)行免疫干預(yù)治療膠原誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的可行性與有效性； 3、探討耐受性樹突狀細(xì)胞治療膠原誘導(dǎo)類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎可能的作用機(jī)制。 研究內(nèi)容： 1、耐受性樹突狀細(xì)胞的誘導(dǎo)和功能鑒定； 提取DBA/1小鼠骨髓細(xì)胞,分別給予GM-CSF、IL-4、不同濃度VIP、Bay進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng),流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞表型,ELISA檢測培養(yǎng)上清液中TNF-α、IFN-γ、 IL-1β、IL-4濃度。結(jié)果：不同濃度VIP、Bay刺激均能使樹突狀細(xì)胞表面分子標(biāo)志MHC Ⅱ、CD40、CD80、CD86表達(dá)下調(diào),與空白組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而樹突狀細(xì)胞特異性表面標(biāo)志CD11c在各組間表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。VIP濃度不同,細(xì)胞成熟表面分子標(biāo)志表達(dá)下調(diào)程度不同,但各組間差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,其中以VIP40ng/ml組下調(diào)最明顯。Bay濃度不同,細(xì)胞成熟表面標(biāo)志表達(dá)降低程度也不同,其中Bay0.5μg/ml組MHCII及CD80降低程度大于0.1μg/ml組,組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義�？瞻譊C組、VIP組、Bay組培養(yǎng)上清液中,TNF-α及IL-1β水平在各組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而IFN-γ水平在VIP-DC及Bay-DC組均較空白DC組降低(P0.05),而IL-4水平則較空白DC組明顯升高(P0.05)。VIP40ng/ml及Bay0.5μg/ml是最適合的培養(yǎng)條件。 2、耐受性樹突狀細(xì)胞治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的療效； 采用牛Ⅱ型膠原乳劑足部注射誘導(dǎo)DBA/1小鼠實(shí)驗(yàn)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎,實(shí)驗(yàn)性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎造模成功后,隨機(jī)分為4組：未發(fā)病組、發(fā)病未治療組、空白DC組、VIP-DC組、Bay-DC組,分別給予生理鹽水、空白DC、VIP-DC及Bay-DC腹腔注射免疫小鼠,采用關(guān)節(jié)炎評分指數(shù)、microMRI和病理檢測滑膜炎程度及骨侵蝕情況評估療效。結(jié)果：VIP-DC及BAY-DC治療組關(guān)節(jié)炎積分下降趨勢較對照及空白DC組明顯,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；足趾和踝關(guān)節(jié)microMRI檢測,VIP-DC組及Bay-DC組CIA小鼠關(guān)節(jié)滑膜增厚程度及腫脹程度均較發(fā)病未治療組及空白DC組有所減輕；受累關(guān)節(jié)病理學(xué)檢查顯示：發(fā)病未治療組和空白DC治療組,滑膜細(xì)胞明顯增厚,細(xì)胞層數(shù)平均增加1倍,VIP-DC和Bay-DC治療后滑膜細(xì)胞增厚有好轉(zhuǎn),但仍厚于正常關(guān)節(jié),各組間雖有變化趨勢,但統(tǒng)計(jì)學(xué)沒有差異。炎癥細(xì)胞浸潤評分、炎癥評分有類似變化。血管翳與骨侵蝕明顯相關(guān),發(fā)病未治療和空白DC組血管翳增生明顯,VIP-DC臺療后血管翳消失,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p=0.005),Bay-DC治療后血管翳有好轉(zhuǎn),但差異沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。VIP-DC及Bay-DC組均較發(fā)病未治療組及空白DC組具有較少的骨侵蝕(P=0.002,P=0.026)。與未發(fā)病組比較,其他各組滑膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞浸潤、血管翳、炎癥及骨侵蝕評分增加,P0.05,均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。VIP-DC組與Bay-DC組比較,血管翳評分減少,P0.05。 3、耐受性樹突狀細(xì)胞治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎機(jī)制研究 采用ELISA法檢測模型鼠血清抗Ⅱ型膠原抗體及致炎因子TNF-α、IFN-γ、IL-1β及抑炎因子IL-4濃度。結(jié)果：抗Ⅱ型膠原抗體發(fā)病未治療組明顯高于未發(fā)病組,空白DC組、VIP-DC組、Bay-DC有下降趨勢,但沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。與未發(fā)病組比,發(fā)病未治療組TNF-a明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)意義,IFN-γ、IL-1β有升高趨勢,IL-4濃度有降低趨勢,但沒有統(tǒng)計(jì)意義(P0.05)。與發(fā)病未治療組比,VIP-DC治療后TNF-α、IL-1β濃度降低,差異有統(tǒng)計(jì)意義(P0.05),Bay-DC j治療后IFN-γ、 IL-1β明顯降低,IL-4明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)意義(P0.05)。 研究結(jié)論： 1、VIP, Bay誘導(dǎo)的耐受性樹突狀細(xì)胞具有低表達(dá)MHCⅡ、CD40、CD80、 CD86分子,高表達(dá)CDllc特性,并高水平分泌IL-4,低水平分泌IFN-γ。 2、VIP-DC及Bay-DC臺療后CIA小鼠關(guān)節(jié)炎指數(shù)下降,microMRI檢測的關(guān)節(jié)炎癥程度、滑膜增厚、關(guān)節(jié)腫脹減輕；病理顯示VIP-DC及Bay-DC治療后骨侵蝕減輕,VIP-DC治療血管翳評分明顯減低。 3、VIP-DC及Bay-DC的作用機(jī)制可能通過減少抗Ⅱ型膠原抗體的產(chǎn)生,抑制促炎因子產(chǎn)生、增加抑炎因子產(chǎn)生而減輕關(guān)節(jié)炎癥、減輕滑膜炎和骨侵蝕。
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R593.22

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：2562262