【摘要】：目的:類風濕性關節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種主要以關節(jié)滑膜組織炎癥為特點的全身性自身免疫反應。該病可導致骨和軟骨的破壞和變性,關節(jié)發(fā)生畸形和強直。RA發(fā)病機制復雜,目前仍未完全闡明,且病情常常遷延難愈,嚴重損害患者的生命健康。因此探討RA的發(fā)病因素及致病機制對于RA疾病的治療有重要的研究價值。本研究通過對關節(jié)滑膜成纖維細胞樣滑膜細胞中鈣粘附蛋白-11(Cadherin-11,可縮寫為Cad-11)的表達與miR-144、RA的相關性進行研究,以探討mi R-144過表達慢病毒在RA小鼠滑膜組織病理進程的作用及其病理機制。方法選擇BALB/c 6-8周小鼠12只,雌雄各半,體質(zhì)量為(20±2)g,隨機選取將其隨機分為3組,即正常組、佐劑組和模型組,其中模型組為將Ⅱ型膠原乳劑注射至BALB/c小鼠尾根部皮下構(gòu)建由Ⅱ型膠原誘導的關節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠模型。進行各組膝關節(jié)滑膜組織的病理學比較。在細胞學層面上,進行成纖維細胞樣滑膜細胞(FLSs)原代培養(yǎng),并分組干預。分為空白對照小鼠(CT)FLSs組、類風濕關節(jié)炎模型(RA)FLSs組,RA+miR-144組及RA+Anti-mi R-144組,q PCR技術進行檢測各組miR-144、Cadherin-11、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6水平,Western實驗檢測各組細胞中Cadherin-11的表達。進而利用ELISA測量培養(yǎng)細胞上清中炎性因子的含量,包括TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6等。在體內(nèi)干預實驗部分,利用12只CIA模型小鼠,隨機分為3組,即鹽水組,空載組和mi R-144組,其中mi R-144組是以miR-144過表達慢病毒進行尾靜脈注射處理。對模型小鼠滑膜組織進行HRP標記抗體法及免疫組化檢測Cadherin-11和TNF-α的表達和分布,并用HE染色檢測滑膜組織的病理變化特點。結(jié)果(1)用于檢測建模情況的3組小鼠分別經(jīng)未做特殊處理、佐劑乳劑處理和Ⅱ型膠原處理處理后,其膝關節(jié)滑膜組織的病理切片在光鏡下觀察提示:正常組和佐劑組小鼠經(jīng)不同處理后,其膝關節(jié)的滑膜組織中細胞分布均勻且排列規(guī)則,局部無炎性細胞浸潤和血管翳形成,膝關節(jié)的軟骨細胞排列規(guī)則、軟骨組織表面光滑。模型組小鼠膝關節(jié)局部炎癥反應明顯,單核細胞大量增生,并有中性粒細胞和淋巴細胞的浸潤,有部分組織的水腫和滑膜層細胞增生和血管翳的形成,滑膜組織中出現(xiàn)細胞纖維化和纖維性滲出,并有膠原纖維的沉積,關節(jié)軟骨組織破壞嚴重。運用實時定量基因擴增熒光檢測系統(tǒng)測定ct組和ra組mir-144、cadherin-11及炎性因子水平,結(jié)果顯示,ra組mir-144明顯低于ct組,cad-11、tnf-α、il-1、il-6水平明顯高于ct組(p0.05),il-2兩組未見統(tǒng)計學差異(p0.05)。(2)細胞學體外檢測,在ra組及ra+mir-144組,其cad-11水平無統(tǒng)計學差異(p0.05),但均明顯高于ct組和ra+anti-mir-144組(p0.05)。ra+mir-144組其tnf-α、il-1、il-6水平明顯低于ra組(p0.05)。四組il-2水平無明顯統(tǒng)計學差異(p0.05)。運用western-blot實驗檢測結(jié)果提示ct組和ra未轉(zhuǎn)染mir-144組可觀察到明顯的蛋白印跡,經(jīng)轉(zhuǎn)染mir-144的ra小鼠成纖維細胞樣滑膜細胞中未看到明顯的蛋白印跡,而ra+anti-mir-144組同樣可以看到明顯的蛋白印跡。定量提示ra組cadherin-11水平明顯高于ct組(p0.05),而經(jīng)轉(zhuǎn)染mir-144的ra小鼠flss中cadherin-11水平明顯低于ra組與ra+anti-mir-144組(p0.05)。elisa結(jié)果提示ra+mir-144組其tnf-α、il-1、il-6水平明顯低于ra組和ra+anti-mir-144組(p0.05),而ra組和ra+anti-mir-144組其tnf-α、il-1、il-6無明顯統(tǒng)計學差異(p0.05)。四組中的il-2均無明顯統(tǒng)計學差異(p0.05)。(3)在體實驗部分,各組膝關節(jié)滑膜組織的病理切片在光鏡下觀察提示:鹽水組和空載組小鼠經(jīng)處理后,膝關節(jié)的炎癥反應明顯,炎性浸潤并有滑膜細胞增生和血管翳生成,軟骨組織受損。mir-144組小鼠膝關節(jié)的滑膜細胞均勻排列規(guī)則,局部無典型的炎癥反應,軟骨組織未受破壞。免疫組化染色顯示:tnf-α散在分布于膝關節(jié)的滑膜層中。經(jīng)image-proplus6.0軟件分析,提示鹽水組、空載組、mirna組tnf-α表達百分數(shù)分別為0.79±0.05、0.73±0.07、0.28±0.04;鹽水組與空載組的ra模型小鼠滑膜層中tnf-α的表達水平相接近,兩組間滑膜層tnf-α的表達水平無顯著差異(p0.05);ra模型小鼠經(jīng)mir-144高表達慢病毒處理后,滑膜組織tnf-α表達水平明顯下降,其差異具有統(tǒng)計學意義(p0.05)。mirna高表達慢病毒處理后ra模型小鼠膝關節(jié)滑膜組織在熒光顯微鏡下觀察提示:cadherin-11蛋白均勻地分布于膝關節(jié)的滑膜層細胞,細胞形態(tài)與既往報道的flss的形態(tài)一致。結(jié)果經(jīng)image-proplus6.0軟件分析,提示鹽水組、空載組、mirna組cadherin-11表達百分數(shù)分別為0.45±0.07、0.36±0.06、0.12±0.03,鹽水組和空載組經(jīng)生理鹽水與經(jīng)空載慢病毒液處理的ra模型小鼠滑膜層細胞中cadherin-11蛋白表達水平相近,經(jīng)檢驗,這兩組之間滑膜層細胞的cadherin-11蛋白的表達水平無顯著差異(p0.05);但實驗組小鼠注射mi-RNA高表達慢病毒后,滑膜層細胞的Cadherin-11蛋白表達水平較其他組明顯下降,經(jīng)檢驗,注射mi RNA高表達慢病毒小鼠與其他兩組小鼠之間滑膜層細胞Cadherin-11蛋白的表達差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)。結(jié)論機體中mi RNA-144增加可減弱或抑制關節(jié)炎模型小鼠中滑膜組織的炎癥反應,并下調(diào)其TNF-α的表達,且這一作用是miRNA-144抑制滑膜細胞中Cadherin-11的效應。機體mi RNA-144的增加可以使RA模型小鼠滑膜炎癥反應的病理進程趨于緩解和好轉(zhuǎn),并降低滑膜組織局部TNF-α、IL-1、IL-6水平的表達,因此,基于“miRNA-144高表達慢病毒”策略可望會成為治療RA的重要手段之一,但其臨床應用的可能尚需要更加深入的機制研究和大量的動物實驗觀察。
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R593.22

【參考文獻】

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1 康夏;康菲;楊波;郭洪峰;權毅;董世武;;miRNA-144靶向調(diào)節(jié)鈣粘蛋白11對間充質(zhì)干細胞成骨分化的抑制效應[J];第三軍醫(yī)大學學報;2013年10期

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本文編號：2519224