【摘要】：目的:類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是一種主要以關(guān)節(jié)滑膜組織炎癥為特點(diǎn)的全身性自身免疫反應(yīng)。該病可導(dǎo)致骨和軟骨的破壞和變性,關(guān)節(jié)發(fā)生畸形和強(qiáng)直。RA發(fā)病機(jī)制復(fù)雜,目前仍未完全闡明,且病情常常遷延難愈,嚴(yán)重?fù)p害患者的生命健康。因此探討RA的發(fā)病因素及致病機(jī)制對(duì)于RA疾病的治療有重要的研究?jī)r(jià)值。本研究通過對(duì)關(guān)節(jié)滑膜成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞中鈣粘附蛋白-11(Cadherin-11,可縮寫為Cad-11)的表達(dá)與miR-144、RA的相關(guān)性進(jìn)行研究,以探討mi R-144過表達(dá)慢病毒在RA小鼠滑膜組織病理進(jìn)程的作用及其病理機(jī)制。方法選擇BALB/c 6-8周小鼠12只,雌雄各半,體質(zhì)量為(20±2)g,隨機(jī)選取將其隨機(jī)分為3組,即正常組、佐劑組和模型組,其中模型組為將Ⅱ型膠原乳劑注射至BALB/c小鼠尾根部皮下構(gòu)建由Ⅱ型膠原誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎(collagen-induced arthritis,CIA)小鼠模型。進(jìn)行各組膝關(guān)節(jié)滑膜組織的病理學(xué)比較。在細(xì)胞學(xué)層面上,進(jìn)行成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞(FLSs)原代培養(yǎng),并分組干預(yù)。分為空白對(duì)照小鼠(CT)FLSs組、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎模型(RA)FLSs組,RA+miR-144組及RA+Anti-mi R-144組,q PCR技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)各組miR-144、Cadherin-11、TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6水平,Western實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞中Cadherin-11的表達(dá)。進(jìn)而利用ELISA測(cè)量培養(yǎng)細(xì)胞上清中炎性因子的含量,包括TNF-α、IL-1、IL-2、IL-6等。在體內(nèi)干預(yù)實(shí)驗(yàn)部分,利用12只CIA模型小鼠,隨機(jī)分為3組,即鹽水組,空載組和mi R-144組,其中mi R-144組是以miR-144過表達(dá)慢病毒進(jìn)行尾靜脈注射處理。對(duì)模型小鼠滑膜組織進(jìn)行HRP標(biāo)記抗體法及免疫組化檢測(cè)Cadherin-11和TNF-α的表達(dá)和分布,并用HE染色檢測(cè)滑膜組織的病理變化特點(diǎn)。結(jié)果(1)用于檢測(cè)建模情況的3組小鼠分別經(jīng)未做特殊處理、佐劑乳劑處理和Ⅱ型膠原處理處理后,其膝關(guān)節(jié)滑膜組織的病理切片在光鏡下觀察提示:正常組和佐劑組小鼠經(jīng)不同處理后,其膝關(guān)節(jié)的滑膜組織中細(xì)胞分布均勻且排列規(guī)則,局部無炎性細(xì)胞浸潤(rùn)和血管翳形成,膝關(guān)節(jié)的軟骨細(xì)胞排列規(guī)則、軟骨組織表面光滑。模型組小鼠膝關(guān)節(jié)局部炎癥反應(yīng)明顯,單核細(xì)胞大量增生,并有中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞的浸潤(rùn),有部分組織的水腫和滑膜層細(xì)胞增生和血管翳的形成,滑膜組織中出現(xiàn)細(xì)胞纖維化和纖維性滲出,并有膠原纖維的沉積,關(guān)節(jié)軟骨組織破壞嚴(yán)重。運(yùn)用實(shí)時(shí)定量基因擴(kuò)增熒光檢測(cè)系統(tǒng)測(cè)定ct組和ra組mir-144、cadherin-11及炎性因子水平,結(jié)果顯示,ra組mir-144明顯低于ct組,cad-11、tnf-α、il-1、il-6水平明顯高于ct組(p0.05),il-2兩組未見統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。(2)細(xì)胞學(xué)體外檢測(cè),在ra組及ra+mir-144組,其cad-11水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),但均明顯高于ct組和ra+anti-mir-144組(p0.05)。ra+mir-144組其tnf-α、il-1、il-6水平明顯低于ra組(p0.05)。四組il-2水平無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。運(yùn)用western-blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)果提示ct組和ra未轉(zhuǎn)染mir-144組可觀察到明顯的蛋白印跡,經(jīng)轉(zhuǎn)染mir-144的ra小鼠成纖維細(xì)胞樣滑膜細(xì)胞中未看到明顯的蛋白印跡,而ra+anti-mir-144組同樣可以看到明顯的蛋白印跡。定量提示ra組cadherin-11水平明顯高于ct組(p0.05),而經(jīng)轉(zhuǎn)染mir-144的ra小鼠flss中cadherin-11水平明顯低于ra組與ra+anti-mir-144組(p0.05)。elisa結(jié)果提示ra+mir-144組其tnf-α、il-1、il-6水平明顯低于ra組和ra+anti-mir-144組(p0.05),而ra組和ra+anti-mir-144組其tnf-α、il-1、il-6無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。四組中的il-2均無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。(3)在體實(shí)驗(yàn)部分,各組膝關(guān)節(jié)滑膜組織的病理切片在光鏡下觀察提示:鹽水組和空載組小鼠經(jīng)處理后,膝關(guān)節(jié)的炎癥反應(yīng)明顯,炎性浸潤(rùn)并有滑膜細(xì)胞增生和血管翳生成,軟骨組織受損。mir-144組小鼠膝關(guān)節(jié)的滑膜細(xì)胞均勻排列規(guī)則,局部無典型的炎癥反應(yīng),軟骨組織未受破壞。免疫組化染色顯示:tnf-α散在分布于膝關(guān)節(jié)的滑膜層中。經(jīng)image-proplus6.0軟件分析,提示鹽水組、空載組、mirna組tnf-α表達(dá)百分?jǐn)?shù)分別為0.79±0.05、0.73±0.07、0.28±0.04;鹽水組與空載組的ra模型小鼠滑膜層中tnf-α的表達(dá)水平相接近,兩組間滑膜層tnf-α的表達(dá)水平無顯著差異(p0.05);ra模型小鼠經(jīng)mir-144高表達(dá)慢病毒處理后,滑膜組織tnf-α表達(dá)水平明顯下降,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。mirna高表達(dá)慢病毒處理后ra模型小鼠膝關(guān)節(jié)滑膜組織在熒光顯微鏡下觀察提示:cadherin-11蛋白均勻地分布于膝關(guān)節(jié)的滑膜層細(xì)胞,細(xì)胞形態(tài)與既往報(bào)道的flss的形態(tài)一致。結(jié)果經(jīng)image-proplus6.0軟件分析,提示鹽水組、空載組、mirna組cadherin-11表達(dá)百分?jǐn)?shù)分別為0.45±0.07、0.36±0.06、0.12±0.03,鹽水組和空載組經(jīng)生理鹽水與經(jīng)空載慢病毒液處理的ra模型小鼠滑膜層細(xì)胞中cadherin-11蛋白表達(dá)水平相近,經(jīng)檢驗(yàn),這兩組之間滑膜層細(xì)胞的cadherin-11蛋白的表達(dá)水平無顯著差異(p0.05);但實(shí)驗(yàn)組小鼠注射mi-RNA高表達(dá)慢病毒后,滑膜層細(xì)胞的Cadherin-11蛋白表達(dá)水平較其他組明顯下降,經(jīng)檢驗(yàn),注射mi RNA高表達(dá)慢病毒小鼠與其他兩組小鼠之間滑膜層細(xì)胞Cadherin-11蛋白的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論機(jī)體中mi RNA-144增加可減弱或抑制關(guān)節(jié)炎模型小鼠中滑膜組織的炎癥反應(yīng),并下調(diào)其TNF-α的表達(dá),且這一作用是miRNA-144抑制滑膜細(xì)胞中Cadherin-11的效應(yīng)。機(jī)體mi RNA-144的增加可以使RA模型小鼠滑膜炎癥反應(yīng)的病理進(jìn)程趨于緩解和好轉(zhuǎn),并降低滑膜組織局部TNF-α、IL-1、IL-6水平的表達(dá),因此,基于“miRNA-144高表達(dá)慢病毒”策略可望會(huì)成為治療RA的重要手段之一,但其臨床應(yīng)用的可能尚需要更加深入的機(jī)制研究和大量的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)觀察。
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R593.22

【參考文獻(xiàn)】

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1 康夏;康菲;楊波;郭洪峰;權(quán)毅;董世武;;miRNA-144靶向調(diào)節(jié)鈣粘蛋白11對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化的抑制效應(yīng)[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2013年10期

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本文編號(hào)：2519224