【摘要】：骨質(zhì)疏松是一種常見(jiàn)的骨代謝性疾病,其中因雌激素缺乏導(dǎo)致的骨量下降常見(jiàn)于絕經(jīng)后婦女,稱為雌激素缺乏性骨質(zhì)疏松。臨床表現(xiàn)為骨脆性增加,易發(fā)生骨折;組織學(xué)表現(xiàn)為骨密度降低,骨小梁數(shù)目減少,骨髓腔內(nèi)脂肪增多。目前,有關(guān)雌激素缺乏所致骨質(zhì)疏松的治療以抑制破骨細(xì)胞活性,減少骨吸收為主,并沒(méi)有真正恢復(fù)成骨能力,因此不能完全解決骨量下降的問(wèn)題。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells,BMMSCs)來(lái)源于中胚層,是一類具有自我更新能力和多分化潛能的成纖維樣、貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞。在研究成骨異常的骨質(zhì)疏松中具有重要意義。自噬(Autophagy)是細(xì)胞利用自身細(xì)胞器來(lái)源的膜結(jié)構(gòu)進(jìn)行組裝、延長(zhǎng),吞噬胞漿內(nèi)底物如錯(cuò)誤折疊、衰老蛋白及受損的細(xì)胞器,再與溶酶體結(jié)合將吞噬物降解并循環(huán)再利用的過(guò)程。自噬水平受多因素的影響,包括營(yíng)養(yǎng)缺乏、應(yīng)激、激素水平變化、炎性環(huán)境等。雌激素缺乏條件下,小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的自噬水平有何變化,自噬水平的變化是否影響其分化平衡尚不清楚。因此本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了雌激素缺乏性骨質(zhì)疏松小鼠中BMMSCs自噬水平的變化,并進(jìn)一步探索自噬對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化功能的影響。旨在進(jìn)一步探索雌激素缺乏性骨質(zhì)疏松癥的發(fā)病機(jī)制,并為該病的治療方法提供新的理論基礎(chǔ)。第一部分雌激素缺乏性骨質(zhì)疏松小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自噬水平的變化研究目的:(1)通過(guò)卵巢摘除術(shù)(Ovariectomy,OVX)和假手術(shù)(Sham)構(gòu)建雌激素缺乏性骨質(zhì)疏松及對(duì)照組小鼠模型。(2)明確雌激素缺乏性骨質(zhì)疏松小鼠的BMMSCs的自噬水平與假手術(shù)組BMMSCs的自噬水平之間是否存在差異。研究方法:(1)通過(guò)OVX和Sham手術(shù)構(gòu)建小鼠雌激素缺乏性骨質(zhì)疏松模型和對(duì)照模型,2月后使用顯微計(jì)算機(jī)斷層掃描術(shù)(Micro computed tomography,micro CT)分析小鼠骨密度(Bone mineral density,BMD)、骨量/組織量(Bone volume/tissue volume,BV/TV)鑒定模型是否構(gòu)建成功。(2)全骨髓培養(yǎng)法分離、純化OVX BMMSCs和Sham BMMSCs,用Western Blot檢測(cè)各組Beclin1、LC3蛋白表達(dá)量;RT-PCR檢測(cè)各組Beclin1、LC3 m RNA表達(dá)量;細(xì)胞免疫熒光染色檢測(cè)細(xì)胞中LC3熒光強(qiáng)度;透射電子顯微鏡(Transmission Electron Microscopy,TEM)檢測(cè)胞漿內(nèi)自噬體數(shù)量。研究結(jié)果:(1)microCT結(jié)果表明:OVX組小鼠BMD、BV/TV明顯小于Sham組小鼠。(2)Western Blot結(jié)果顯示:OVX BMMSCs的Beclin1、LC3蛋白表達(dá)量低于Sham BMMSCs;RT-PCR結(jié)果顯示:OVX BMMSCs的Beclin1、LC3 m RNA表達(dá)量低于Sham BMMSCs;細(xì)胞免疫熒光顯示:OVX BMMSCs LC3熒光強(qiáng)度弱于Sham BMMSCs;TEM結(jié)果顯示:OVX BMMSCs中自噬體數(shù)量少于Sham BMMSCs。結(jié)論:(1)通過(guò)OVX術(shù)成功構(gòu)建雌激素缺乏性骨質(zhì)疏松小鼠模型。(2)雌激素缺乏性骨質(zhì)疏松小鼠BMMSCs自噬水平較假手術(shù)組BMMSCs下降。第二部分體外調(diào)節(jié)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞自噬水平對(duì)其分化功能的影響實(shí)驗(yàn)?zāi)康?(1)探討體外激活OVX小鼠BMMSCs自噬水平對(duì)其分化功能的影響。(2)探討體外抑制Sham小鼠BMMSCs自噬水平對(duì)其分化功能的影響。實(shí)驗(yàn)方法:(1)建立Sham BMMSCs組、OVX BMMSCs組、OVX BMMSCs經(jīng)自噬激活劑雷帕霉素(Rapamycin)刺激組,即OVX+Rapamycin組,用Western Blot檢測(cè)各組BMMSCs中成骨蛋白R(shí)unx2、Osteorix,成脂蛋白PPAR-γ的表達(dá)量。用茜素紅染色檢測(cè)各組BMMSCs礦化能力,用油紅O染色檢測(cè)各組BMMSCs脂滴形成能力。(2)建立Sham BMMSCs組,Sham BMMSCs經(jīng)自噬抑制劑3甲基腺嘌呤(3-methyladenine,3-MA)刺激組,即Sham+3-MA組,實(shí)驗(yàn)方法和檢測(cè)指標(biāo)同上。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)Western Blot結(jié)果可見(jiàn):OVX+Rapamycin BMMSCs成骨蛋白R(shí)unx2、Osteorix表達(dá)量高于,成脂蛋白PPAR-γ表達(dá)量低于OVX BMMSCs;茜素紅染色表明:OVX+Rapamycin BMMSCs礦化能力強(qiáng)于OVX BMMSCs;油紅O染色結(jié)果提示:OVX+Rapamycin BMMSCs脂滴形成能力弱于OVX BMMSC。(2)Western Blot結(jié)果表明:Sham+3-MA成骨蛋白R(shí)unx2、Osteorix表達(dá)量低于,成脂蛋白PPAR-γ表達(dá)量高于Sham BMMSCs;茜素紅染色表明:Sham+3-MA BMMSCs礦化能力較Sham BMMSCs低;油紅O染色結(jié)果提示:Sham+3-MA BMMSCs脂滴形成能力較Sham BMMSC高。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:(1)體外激活OVX BMMSCs自噬能夠促進(jìn)其成骨分化,降低其成脂分化,(2)體外抑制Sham BMMSCs自噬水平會(huì)抑制其成骨分化,促進(jìn)其成脂分化。以上結(jié)論說(shuō)明自噬影響B(tài)MMSCs的分化平衡。第三部分改變小鼠體內(nèi)自噬水平對(duì)骨量及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化功能的影響實(shí)驗(yàn)?zāi)康?(1)探討提高OVX小鼠體內(nèi)自噬水平對(duì)骨量及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化功能的影響。(2)探討抑制Sham小鼠體內(nèi)自噬水平對(duì)骨量及骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化功能的影響。實(shí)驗(yàn)方法:(1)建立Sham組、OVX組及OVX腹腔注射Rapamycin組(OVX+Rapamycin)小鼠,一月后用micro CT檢測(cè)并分析各組脛骨骨密度(BMD)、骨量/組織量(BV/TV);用鈣黃綠素標(biāo)記對(duì)比各組新骨形成速率;用油紅O染色對(duì)比各組骨髓腔內(nèi)脂滴數(shù)量;用RT-PCR檢測(cè)并對(duì)比各組骨髓組織PPAR-γm RNA表達(dá)量;用茜素紅染色檢測(cè)對(duì)比各組小鼠取材來(lái)源的BMMSCs的礦化能力;用油紅O染色對(duì)比各組小鼠取材來(lái)源的BMMSCs脂滴形成能力。(2)建立Sham組、Sham腹腔注射3-MA組(Sham+3-MA)小鼠,一月后,用上述相同實(shí)驗(yàn)技術(shù)檢測(cè)并對(duì)比BMD、BV/TV、新骨形成速率、骨髓內(nèi)PPAR-γm RNA表達(dá)水平、兩組動(dòng)物取材來(lái)源的BMMSCs的礦化能力及脂滴形成能力。實(shí)驗(yàn)結(jié)果:(1)microCT結(jié)果表明:OVX+Rapamycin組小鼠脛骨BMD、BV/TV均高于OVX組小鼠;鈣黃綠素標(biāo)記結(jié)果說(shuō)明:OVX+Rapamycin組小鼠骨形成速率高于OVX組小鼠;油紅O染色結(jié)果表明:OVX+Rapamycin組小鼠髓腔內(nèi)脂滴數(shù)量少于OVX組小鼠;RT-PCR檢測(cè)提示:OVX+Rapamycin組小鼠骨髓組織PPAR-γm RNA表達(dá)量低于OVX組小鼠;茜素紅染色結(jié)果提示:OVX+Rapamycin組小鼠來(lái)源的BMMSCs礦化能力在成骨誘導(dǎo)前后均高于OVX組小鼠來(lái)源的BMMSCs;油紅O染色結(jié)果表明:OVX+Rapamycin組小鼠來(lái)源的BMMSCs脂滴能力在成脂誘導(dǎo)前后均低于OVX組小鼠來(lái)源的BMMSCs。(2)Sham+3-MA組小鼠脛骨BMD、BV/TV較Sham組小鼠低;鈣黃綠素標(biāo)記結(jié)果為:Sham+3-MA組小鼠骨皮質(zhì)中鈣黃綠素沉積線間距較Sham組小鼠間距窄;油紅O染色結(jié)果表明:Sham+3-MA組小鼠髓腔內(nèi)脂滴數(shù)量較Sham組小鼠多;RT-PCR檢測(cè)結(jié)果可見(jiàn):Sham+3-MA組小鼠骨髓組織內(nèi)PPAR-γm RNA表達(dá)量較Sham組小鼠高;茜素紅染色結(jié)果提示:Sham+3-MA組小鼠來(lái)源的BMMSCs礦化能力在成骨誘導(dǎo)前后均低于Sham組小鼠來(lái)源的BMMSCs;油紅O染色結(jié)果表明:Sham+3-MA組小鼠來(lái)源的BMMSCs脂滴形成能力在成脂誘導(dǎo)前后均高于Sham組小鼠來(lái)源的BMMSCs。實(shí)驗(yàn)結(jié)論:(1)激活OVX小鼠全身自噬水平,能夠增加骨量,減少骨髓腔內(nèi)脂肪組織形成,同時(shí)BMMSCs成骨分化增強(qiáng)而成脂分化減弱;(2)抑制Sham小鼠全身自噬水平,出現(xiàn)骨量減少,骨髓腔內(nèi)脂肪組織形成增多,同時(shí)BMMSCs成骨分化減弱而成脂分化增強(qiáng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R580

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本文編號(hào)：2496937