【摘要】：目的:杜興肌肉萎縮癥(Duchenne Muscular Dystrophy-DMD)是一種罕見遺傳性疾病,是由編碼dystrophin蛋白的DMD基因突變導致功能性dystrophin蛋白缺失而引起。該疾病在新生男孩中的發(fā)病率為1/3500,主要表現(xiàn)為進行性肌肉萎縮,疾病發(fā)展后期出現(xiàn)心肌肥大、呼吸衰竭等癥狀,最終導致病人死亡。目前臨床上尚無有效的治療DMD的方法,對DMD治療研究主要集中于緩解DMD病人肌肉萎縮癥狀及恢復功能性dystrophin蛋白表達,其中以肌肉生長抑制因子(myostatin)為主要作用靶點的輔助治療研究受到廣泛關注。其作用機制是通過其前體短肽myostatin-propeptide抑制myostatin的活性,解除myostatin對肌肉的負性調控作用,促進肌肉再生分化,達到緩解DMD所引起的肌肉萎縮的目的。眾所周知,短肽在血液中極不穩(wěn)定,半衰期較短,而本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),哺乳類細胞分泌的一種納米級囊泡結構-外泌體(exosome),可作為蛋白和核酸藥物的運輸載體,并對核酸起到一定保護作用。因此,在本研究中,我們擬利用杜興肌肉萎縮癥小鼠模型(mdx小鼠),系統(tǒng)研究exosome作為propeptide短肽運輸載體的可行性和應用潛力,通過檢測負載propeptide短肽的exosome對DMD肌肉的改善作用,以期為DMD治療提供一種新型藥物運輸載體和治療手段。方法:利用RT-PCR獲取小鼠myostatin propeptide基因序列,構建CD63-propeptide(CD63-Pro)融合表達質粒。利用慢病毒感染小鼠NIH3T3細胞系,獲得穩(wěn)定表達CD63-Pro融合短肽的細胞系。通過超速離心和超濾法收集CD63-Prop融合表達細胞分泌的外泌體(EXOmyo-pro),利用Western Blot檢測確認穩(wěn)定表達細胞系及其分泌外泌體中propeptide的表達水平。為確定EXOmyo-pro與血清中myostatin的結合能力,將EXO或EXOmyo-pro以10mg/kg劑量通過尾靜脈注射到C57BL/6小鼠體內,在循環(huán)24h后,收集血清,離心去除血清中外泌體,再利用Western Blot檢測血清中myostatin表達。分別在細胞模型、CTX損傷的C57BL/6急性損傷和dystrophin蛋白缺失的mdx小鼠模型上,系統(tǒng)測試不同劑量EXOmyo-pro對肌肉細胞、急性和慢性肌肉損傷的再生修復作用。利用HE染色檢測損傷組織形態(tài)及肌纖維面積、IHC檢測胚胎肌球重鏈(e My HC)表達以評估修復效果;Western Blot檢測分化相關標志蛋白Myo D、Myo G表達以確定EXOmyo-pro對肌肉分化的影響。除此之外,在mdx小鼠上系統(tǒng)測試EXOmyo-pro反復給藥對mdx小鼠體重、抓力、肌肉重量及肌纖維面積等的改善情況以確定其作用效果。結果:成功構建CD63-Pro融合表達的NIH3T3細胞系,并證明融合表達細胞及其分泌的exosomes中表達propeptide。與血清中myostatin的結合試驗表明:EXOmyo-pro能夠顯著降低小鼠血清中myostatin表達,說明EXOmyo-pro能夠與血清中的myostatin高效結合。體外細胞試驗結果顯示,EXOmyo-pro處理組較對照組Myo G表達升高,說明EXOmyo-pro能夠抑制myostatin活性,從而促進細胞分化。在C57BL/6局部肌肉急性損傷模型上的測試結果顯示,與對照組相比,EXOmyo-pro處理組肌肉重量增加、肌纖維面積增大、e My HC表達增加,說明EXOmyo-pro能夠增強急性損傷后的肌肉再生修復能力。在mdx小鼠上的不同劑量測試表明,與10mg/kg三次注射相比,20mg/kg三次注射能夠顯著提高mdx小鼠肌肉功能及肌纖維分化再生能力。在mdx小鼠上按20mg/kg的劑量重復注射的結果表明:與單次注射相比,多次重復注射能夠顯著增加mdx小鼠體重、肌肉重量及抓力;EXOmyo-pro處理組Myo D、Myo G表達明顯升高,說明EXOmyo-pro對mdx小鼠肌肉再生、分化及增殖具有累積作用。與3次重復注射相比,5次EXOmyo-pro連續(xù)注射對mdx小鼠肌肉增殖、分化等具有顯著增強效果。結論:我們的研究結果表明:exosome可作為myostatin--propeptide的運輸載體能夠與血清中myostatin高效結合并抑制myostatin活性,從而促進損傷肌肉的再生、增殖和分化,改善mdx小鼠肌肉狀態(tài),為propeptide介導的DMD輔助治療提供一種新型運輸載體系統(tǒng)。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：天津醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R596

【參考文獻】

相關期刊論文 前2條

1 呂乃武;楊曉鳳;許憶峰;張軼斌;王紅梅;吳雁翔;單鴻;崔激平;周金旭;;骨髓和臍血間質干細胞聯(lián)合移植治療杜氏型進行性肌營養(yǎng)不良癥269例療效研究[J];中國全科醫(yī)學;2010年14期

2 楊曉鳳;許憶峰;張軼斌;王紅梅;呂乃武;吳雁翔;呂欣;崔激萍;單鴻;周金旭;;骨髓和臍血間充質干細胞聯(lián)合移植治療杜氏型肌營養(yǎng)不良[J];中國組織工程研究與臨床康復;2009年36期

，

本文編號：2467752