【摘要】：目的糖尿病是臨床上的常見病及多發(fā)病,其中有5-10%的糖尿病患者發(fā)生肢體末端的皮膚潰瘍。糖尿病潰瘍主要是由局部缺血、局部神經(jīng)性病變所引起。目前糖尿病潰瘍已經(jīng)成為最常見的非創(chuàng)傷性截肢的原因。近年來,生長(zhǎng)因子療法以及干細(xì)胞,如骨髓來源單核細(xì)胞、脂肪來源干細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞的應(yīng)用在慢性難愈性創(chuàng)面的治療中研究眾多,均有利于增加創(chuàng)面局部新生血管形成,促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖,從而促進(jìn)創(chuàng)面愈合。與其他干細(xì)胞相比,脂肪來源干細(xì)胞具有很多優(yōu)勢(shì),原因在于脂肪組織作為整形外科的副產(chǎn)物,來源豐富,取材方便,對(duì)供區(qū)部位不會(huì)造成太大的損傷,且脂肪組織中干細(xì)胞含量豐富。目前在糖尿病潰瘍治療的研究中,外源性的生長(zhǎng)因子和細(xì)胞移植的應(yīng)用存在一定困難,主要表現(xiàn)在兩個(gè)方面：其一,由于創(chuàng)面的滲液對(duì)細(xì)胞及生長(zhǎng)因子具有沖刷作用,導(dǎo)致移植后細(xì)胞的存活率較低；其二,生長(zhǎng)因子作用時(shí)間不長(zhǎng),且應(yīng)用單一生長(zhǎng)因子的療效也非常有限。利用具有生物活性的人工移植物修復(fù)皮膚缺損近年來受到廣‘泛關(guān)注。膠原是屬于細(xì)胞外基質(zhì)的一種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì),廣泛的存在于皮膚組織中,在皮膚的修復(fù)過程中具有十分重要的作用。由于其良好的生物相容性,適宜的可降解性,以及弱抗原性等特性,適合制成各種生物支架材料。在組織工程學(xué)中,膠原支架材料被廣泛運(yùn)用于組織再生和修復(fù)。在前期研究中,本課題組從小牛筋膜中提取膠原材料制成CBD-VEGF的3D膠原支架通過大鼠糖尿病模型的體內(nèi)實(shí)驗(yàn),證實(shí)其材料具有良好的細(xì)胞粘附性,能很好地支持細(xì)胞遷移并促進(jìn)肉芽組織的形成,有效的將外源性VEGF鎖定于創(chuàng)面局部,并緩慢釋放。ADSCs無論通過何種機(jī)制促進(jìn)創(chuàng)面愈合,都離不開ADSCs的分化功能和旁分泌作用,如果移植后ADSCs的成活數(shù)量不足,ADSCs的分化功能和旁分泌功能都失去了基礎(chǔ),就不會(huì)有高效率愈合。BCL-2基因是抗凋亡基因,有學(xué)者用BCL-2轉(zhuǎn)染骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞抑制凋亡,發(fā)現(xiàn)在體外缺氧環(huán)境下BCL-2使骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡減少了32%,血管內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子分泌增加了60%,體內(nèi)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明轉(zhuǎn)染BCL-2的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成活率提高了1.2-2.2倍,并改善梗死心肌的功能,本課題以前期膠原綁定VEGF(CBD-VEGF)治療糖尿病大鼠潰瘍創(chuàng)面研究結(jié)果為基礎(chǔ),嘗試轉(zhuǎn)染BCL-2的ADSCs結(jié)合3D膠原支架合成完整的促進(jìn)創(chuàng)面愈合的生物支架體系,檢測(cè)其生物活性,并全面評(píng)估該生物支架體系；同時(shí),構(gòu)建小鼠的1型糖尿病潰瘍模型,在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物體內(nèi)評(píng)價(jià)ADSCs/3D膠原生物支架體系的治療效果,從而為糖尿病潰瘍的治療帶來新的希望。材料與方法材料：從小牛筋膜中提�、裥湍z原蛋白,使用凍干技術(shù)將其制成多孔疏松的膠原膜片,裁剪成直徑大小7mm的圓形,厚度1.0mm備用。掃描電鏡觀察膠原膜片形態(tài)、三維結(jié)構(gòu)及孔隙大小。實(shí)驗(yàn)方法體外實(shí)驗(yàn)1.實(shí)驗(yàn)所用脂肪組織取自南京大學(xué)附屬南京鼓樓醫(yī)院整形外科1名行腹部脂肪抽吸術(shù)手術(shù)患者,健康男性,35歲。無菌條件下取脂肪組織100ml,1h內(nèi)將脂肪組織送至實(shí)驗(yàn)室,在超凈臺(tái)中將脂肪組織在PBS液中漂洗3次,盡量去除結(jié)締組織及血管內(nèi)皮,將脂肪顆粒,加入0.1%的Ⅰ型膠原酶,置于搖床上,在37℃,以200次/分鐘震蕩消化1h,取出脂肪以離心力500g離心5min,將細(xì)胞成分與脂肪組織和纖維組織分離,用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞成分,200μm濾篩過濾,將濾液以300g離心力離心5min,去除上清,用完全培養(yǎng)基重懸細(xì)胞,將細(xì)胞接種到25cm2的培養(yǎng)瓶中,放入37℃,5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。接種24h后換液,以后每3d換液一次,24h細(xì)胞開始貼壁,7～10d細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合時(shí),定義為0代,用0.25%trypsin/EDTA消化,完全培養(yǎng)基終止消化,1：2傳代培養(yǎng)。2.采用免疫熒光法標(biāo)記,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)干細(xì)胞表型抗原CD29、CD44、CD90;造血干細(xì)胞抗原標(biāo)志CD34和CD133；成纖維細(xì)胞抗原標(biāo)志HLA-DR。3.構(gòu)建表達(dá)Bcl-2的腺病毒載體(Ad/Bcl-2)和表達(dá)EGFP的腺病毒載體(Ad/EGFP),先以Ad/EGFP按不同感染復(fù)數(shù)(multiplicities of infection, MOI)值轉(zhuǎn)染ADSCs,熒光顯微鏡下觀察EGFP轉(zhuǎn)染效率,并用流式細(xì)胞儀檢測(cè),確定最佳的MOI值,用此值行Bcl-2基因轉(zhuǎn)染。4.采用Western Blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)Ad/Bcl-2轉(zhuǎn)染的ADSCs與單純Ad轉(zhuǎn)染的ADSCs在不同時(shí)間點(diǎn)表達(dá)Bcl-2蛋白的水平,取轉(zhuǎn)染24h、72h和7d的Bcl-2-ADSCs及vector-ADSCs、 ADSCs進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。體內(nèi)試驗(yàn)1.48只10周齡雌性實(shí)驗(yàn)用裸鼠,體重在25-30g之間,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后制備糖尿病模型。每只裸鼠背部設(shè)計(jì)一個(gè)直徑0.7cm的圓形皮膚缺損創(chuàng)面。根據(jù)治療方式將48只裸鼠隨機(jī)分為4組：A組(PBS組,n=12)：創(chuàng)面局部噴灑PBS溶液；B組(scaffold組,n=12)：創(chuàng)面局部應(yīng)用空白膠原膜片；C組(ADSCs/scaffold組,n=12)：創(chuàng)面局部應(yīng)用結(jié)合ADSCs的膠原膜片；D組(BCL-2/ADSCs/scaffold組.,n=12)：創(chuàng)而局部應(yīng)用結(jié)合BCL-2轉(zhuǎn)染ADSCs的膠原膜片；2.在手術(shù)當(dāng)中以及術(shù)后3天、7天、10天和14天拍攝創(chuàng)面照片,計(jì)算各組創(chuàng)面愈合率；3.Dil標(biāo)記ADSCs及BCL-2轉(zhuǎn)染的ADSCs,術(shù)后第7d取C組及D組創(chuàng)面肉芽組織制成冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察ADSCs細(xì)胞存活情況；4.各組于術(shù)后第7d取創(chuàng)面肉芽組織行組織學(xué)觀察,包括HE染色,免疫組化染色,比較各組創(chuàng)而肉芽組織的血管化程度。結(jié)果體外實(shí)驗(yàn)1.掃描電鏡顯示：該膠原膜片具有疏松的三維空間立體結(jié)構(gòu),孔隙范圍在150μm-200μm之間；2.流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示,ADSCs表達(dá)干細(xì)胞相關(guān)標(biāo)記CD34、CD29、CD44和CD90,不表達(dá)HLA-DR,它是成纖維細(xì)胞的表型,也不表達(dá)血液來源的干細(xì)胞表型CD133。3. AD/EGFP轉(zhuǎn)染ADSCs后在熒光顯微鏡下顯示綠色熒光(圖3A),MOI值分別為0、50、100、200時(shí),經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè),AD/EGFP的轉(zhuǎn)染率分別為0、54%、79%、81.5%。4. Western blot檢測(cè)顯示Bcl-2轉(zhuǎn)染24h后蛋白可以表達(dá),隨后表達(dá)逐漸增強(qiáng),3天能夠高表達(dá),可持續(xù)到7天,vector-ADSCs和ADSCs僅能檢測(cè)到微弱的內(nèi)源性表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)1.與A組、B組及C組相比,D組創(chuàng)而愈合率在第7d為81.21±3.7%,顯示出更高的創(chuàng)面愈合率(P0.05或P0.01)；2.C組與D組均可見被DiI標(biāo)記的ADSCs在創(chuàng)而肉芽組織中存活,并在熒光顯微鏡下發(fā)出特殊的紅色熒光；3.HE染色觀察結(jié)果,與A組、B組及C組相比,D組創(chuàng)面肉芽組織切片表現(xiàn)出更顯著的血管化程度；4.免疫組化染色結(jié)果,與A組、B組及C組相比,D組切片表現(xiàn)出更多的血管數(shù)目(A：6.11±2.78個(gè),B：8.9±3.36個(gè),C：15.21±3.87個(gè),D：21.54±4.75個(gè),P0.01)。結(jié)論1.外源性BCL-2基因能夠上調(diào)ADSCs的BCL-2蛋白表達(dá),轉(zhuǎn)染BCL-2的ADSCs能夠顯著降低移植后ADSCs的凋亡；2.結(jié)合BCL-2轉(zhuǎn)染ADSCs的膠原膜片能夠顯著的提高糖尿病裸鼠創(chuàng)面的愈合率,促進(jìn)創(chuàng)面的愈合；3.結(jié)合BCL-2轉(zhuǎn)染ADSCs的膠原膜片能夠有效的增加血管的生成,從而促進(jìn)糖尿病裸鼠創(chuàng)面的愈合。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南京大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R587.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 李強(qiáng);李維佳;黃穎;;間充質(zhì)干細(xì)胞在再生障礙性貧血治療中的應(yīng)用[J];中國組織工程研究與臨床康復(fù);2011年06期

2 劉春喜;李大慶;張運(yùn);姜虹;王榮;王旭平;;兔外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞培養(yǎng)及HTK基因體外修飾[J];基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與臨床;2007年11期

3 姚旺祥;裴國獻(xiàn);劉勇;梅良斌;馬安;;兔胎盤源性間充質(zhì)干祖細(xì)胞的分離方法比較[J];生物醫(yī)學(xué)工程與臨床;2007年02期

4 金譽(yù),單根法,鐘z，

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