【摘要】：目的觀察坎地沙坦(Cand)對大鼠胸主動脈血管平滑肌細(xì)胞株A7r5增殖和分泌血管緊張素Ⅱ(AngⅡ)的影響,并探討其機(jī)制。方法根據(jù)葡萄糖濃度將A7r5細(xì)胞分為兩組,正常糖濃度組(NG,5m M)、高糖組(HG,15、25、35、45m M)將各組細(xì)胞培養(yǎng)48h后,采用CCK-8法測定培養(yǎng)基吸光度值(OD值)以確定最佳葡萄糖濃度。再按照該濃度分別培養(yǎng)A7r5細(xì)胞0、24、48、72h后用CCK-8法測定培養(yǎng)基OD值以確定最佳培養(yǎng)時間。用選定的葡萄糖濃度及培養(yǎng)時間進(jìn)行下一步實驗。Cand選定了3個濃度,分別為HG(25m M)+Cand10-7mol/L、HG(25m M)+Cand10-6mol/L、HG(25m M)+Cand10-5mol/L,采用CCK8法測定OD值,從中擇選出最佳濃度進(jìn)行下一步實驗。最終分為NG(5m M)、HG(25m M)、HG(25m M)+Cand10-5mol/L三組,采用細(xì)胞計數(shù)法和流式細(xì)胞術(shù)檢測A7r5增殖情況,以評價Cand對于高糖誘導(dǎo)的A7r5增殖的影響。采用ELISA法檢測細(xì)胞分泌AngⅡ水平、細(xì)胞免疫熒光染色法測定細(xì)胞膜表面AT1R。最后采用Western blot法檢測p-c-Raf、p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平以探討Cand對A7r5增殖和分泌AngⅡ影響的機(jī)制。結(jié)果1、(1)CCK-8法測定最佳葡萄糖濃度:細(xì)胞培養(yǎng)48h后,與NG(5m M)組相比,HG(15、25、35、45m M)濃度下誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞,OD值均明顯升高,且以HG(25m M)組OD值為(1.044±0.074)增高最為明顯,與NG(5m M)OD值(0.681±0.055)相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);(2)CCK-8法測定最佳培養(yǎng)時間:HG(25m M)組細(xì)胞培養(yǎng)0h(0.436±0.006)相比較,細(xì)胞培養(yǎng)24h(0.717±0.018)、48h(1.044±0.074)、72h(1.062±0.067)OD值均明顯升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P均0.01)。而48h和72h相比,其OD值差異無顯著性(P0.05);(3)CCK-8法測定最佳Cand濃度:A7r5細(xì)胞經(jīng)48h培養(yǎng)后,HG(25m M)+Cand10-5mol/L組OD值為(0.920±0.010),與HG(25m M)組OD值(1.126±0.080)相比有明顯統(tǒng)計學(xué)差異(p0.01),而HG(25m M)+Cand10-7mol/L、HG(25m M)+Cand10-6mol/L組較HG(25m M)組無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。(4)細(xì)胞計數(shù)法結(jié)果:A7r5細(xì)胞培養(yǎng)48h后,與HG(25m M)組細(xì)胞計數(shù)結(jié)果(77.33±2.52)相比,HG(25m M)+Cand10-5mol/L組細(xì)胞數(shù)(64.67±1.16)明顯減少,兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。(5)流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示,與NG(5m M)組比較,HG(25m M)組A7r5細(xì)胞增殖活性明顯增強(qiáng),細(xì)胞周期S期比例[(30.503±1.521)%]明顯增加(P0.01)。與HG(25m M)組比較,HG(25m M)+Cand10-5mol/L組A7r5細(xì)胞增殖活性下降,細(xì)胞周期S期比例[(21.677±1.690)%]下降,兩組差異有統(tǒng)計學(xué)意義(p0.01)。2、(1)ELISA法測AngⅡ結(jié)果顯示:NG(5m M)組OD值為(55.268±0.310)與HG(25m M)組OD值(59.934±0.121)相比,有統(tǒng)計學(xué)差異(p0.01)。而HG(25m M)+Cand10-5mol/L組與HG(25m M)組相比無統(tǒng)計學(xué)差異(p0.05)。(2)細(xì)胞免疫熒光染色法測定結(jié)果:與NG(5m M)組比較,HG(25m M)組細(xì)胞膜上AT1R表達(dá)增加,與HG(25m M)比較,HG(25m M)+Cand10-5mol/L組AT1R表達(dá)減少。3、Western blot結(jié)果顯示:與NG(5m M)組p-c-Raf(0.836±0.039)、p-MEK1/2(1.032±0.034)、p-ERK1/2(1.472±0.089)比較,HG(25m M)組p-c-Raf(1.060±0.087)、p-MEK1/2(1.155±0.064)、p-ERK1/2(1.924±0.065)蛋白質(zhì)表達(dá)水平明顯上調(diào)(p0.01)。與HG(25m M)組相比,HG(25m M)+Cand10-5mol/L組p-c-Raf(0.658±0.039)、p-MEK1/2(0.821±0.049)、p-ERK1/2(0.795±0.028)蛋白表達(dá)下調(diào)(p0.01)。結(jié)論1.高糖促進(jìn)A7r5增殖、升高AngⅡ分泌水平。2.坎地沙坦抑制高糖誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞增殖,但對AngⅡ分泌無影響。3.坎地沙坦抑制高糖誘導(dǎo)的A7r5細(xì)胞增殖其機(jī)制可能與抑制p-c-Raf、p-MEK1/2、p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平有關(guān)。
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【學(xué)位授予單位】：寧夏醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2

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本文編號：2449408