【摘要】：近幾十年,全球整體生活水平提高,體力活動減少而高能量食物攝入增多,全球超重和肥胖人口猛增。肥胖大大增加了糖尿病、心血管疾病等的發(fā)病幾率,嚴重危害人類健康,因此闡明體重調(diào)節(jié)機制和肥胖發(fā)生機理為控制"肥胖疫情"提供指導,成為當前生命科學研究的一個重要任務(wù)�，F(xiàn)在研究認為體重受到"能量穩(wěn)態(tài)"機制的調(diào)控——脂肪細胞分泌的信號分子瘦素通過作用于下丘腦相關(guān)的信號通路雙向調(diào)控體重,肥胖是穩(wěn)態(tài)機制失調(diào)的結(jié)果,但該假說備受爭議。流行病學研究表明,體重受遺傳因素與環(huán)境因素的共同影響,食物過剩及高能量食物盛行是引發(fā)肥胖的主要環(huán)境因素。近年研究發(fā)現(xiàn),Rcan2基因以一種與瘦素無關(guān)的機制增加攝食、促進體重增長,當Rcan2與高脂肪食物共存時引起小鼠體重加速增長,這一發(fā)現(xiàn)可為解釋肥胖和高能量食物的關(guān)系、揭示肥胖爆發(fā)的成因提供一定的科學證據(jù)。Rcan2編碼兩種轉(zhuǎn)錄起始位點不同的剪切變體Rcan2-1、Rcan2-3,之前的研究利用同源重組的方法,將LacZ元件替換二者共用的4號外顯子,制作了Rcan2敲除(Rcan2-/-)小鼠,一方面該小鼠用于基因功能的研究,另一方面,插入的LacZ元件可與Rcan2-1、Rcan2-3各自轉(zhuǎn)錄起始位點所在的外顯子一起轉(zhuǎn)錄翻譯成具有β-半乳糖苷酶活性的Rcan2-1-LacZ、Rcan2-3-LacZ融合蛋白,利用X-Gal染色即可原位檢測Rcan2的表達分布情況。然而兩種剪切變體各自在體重調(diào)節(jié)中發(fā)揮何種作用以及表達分布情況尚不明確,而這正是本論文要解決的核心問題。在本研究中,我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)制作了Rcan2-敲除小鼠(Rcan2-1-/-,2號外顯子上ATG后缺失1個脫氧核苷酸T導致Rcan2-1移碼突變)、Rcan2-3敲除小鼠(Rcan2-3-/-,3號外顯子上ATG后缺失2個脫氧核苷酸AG導致Rcan2-3的移碼突變),經(jīng)傳代和雜合小鼠雌雄交配得到了純合敲除小鼠。4周齡起,將同窩的野生型小鼠分別與兩種純合敲除小鼠組合進行為期16周的體重監(jiān)測實驗。結(jié)果發(fā)現(xiàn),在高脂肪食物喂養(yǎng)下,Rcan2-3-/-小鼠體重較野生型小鼠稍輕,至20周齡時,二者的脂肪、肝臟等組織重量沒有統(tǒng)計學差異,脂肪等的組織形態(tài)學相似且均具有肥胖特征;而Rcan2-1-/-與野生型小鼠組中,4周齡至5周齡,二者體重曲線基本吻合,從6周齡開始二者體重逐漸拉開差距,野生型小鼠的體重增長明顯加快,20周齡時二者體重差接近7g,野生型小鼠的脂肪等的組織形態(tài)呈現(xiàn)肥胖特征,而敲除小鼠相關(guān)組織的形態(tài)沒有異常。上述結(jié)果表明在體重調(diào)節(jié)中起主要作用的可能是Rcan2-1。我們將特異性靶向Rcan2-1、Rcan2-3的CRISPR/Cas9打靶載體分別注射到Rcan2雜合敲除(Rcan2+/-)受精卵中,當Rcan2-3 靶點處的無義突變發(fā)生于帶LacZ的染色體DNA上時,Rcan2-3-LacZ融合蛋白失活,這樣得到了僅保留Rcan2-1-LacZ融合蛋白的小鼠,該小鼠的X-Gal染色結(jié)果原位顯示了 Rcan2-1的表達分布位置,同理可得Rcan2-1-LacZ缺失而僅能檢測Rcan2-3表達分布情況的小鼠。實驗結(jié)果表明,Rcan2-3在胚胎和成體中的表達部位與Rcan2--小鼠的結(jié)果基本重合,在胚胎期9.5(E9.5)天時Rcan2-3已表達,E11.5至E12.5天時Rcan2-3主要分布于端腦泡、中后腦交界處、后腦、延髓、脊髓,E13.5天時其分布范圍擴展至中腦、間腦,隨著發(fā)育進行Rcan2-3在胚胎中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達范圍逐漸擴大,在成體中Rcan2-3集中分布于腦、脊髓且在PVN等神經(jīng)核團有突出表達;而Rcan2-1表達較晚、表達量較少,胚胎E15.5天時檢測到前腦區(qū)有微弱表達,在成體腦中僅丘腦、大腦皮層部分區(qū)域有一定分布。此外,為了進一步證明Rcan2-1、Rcan2-3在肥胖發(fā)生中的功能,我們擬利用Tol2轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)制作帶有FLAG標簽的轉(zhuǎn)基因過表達Rcan2-1FLAG小鼠和Rcan2-3FLAG小鼠。F0代得到了隨機插入Rcan2-1-FLAG、Rcan2-3-FLAG片段且能夠穩(wěn)定傳代的轉(zhuǎn)基因小鼠,然而Westernblot實驗結(jié)果顯示,上述小鼠的腦等組織中均未檢測到FLAG目的蛋白,推測可能與轉(zhuǎn)基因位置效應(yīng)等因素有關(guān)。本研究利用CRISPR/Cas9技術(shù)制作了Rcan2-1、Rcan2-3分別敲除的小鼠模型,體重監(jiān)測實驗顯示,Rcan2-1而非Rcan2-3的缺失明顯地減弱了高脂肪食物引發(fā)的肥胖,由此確定了Rcan2-1在體重調(diào)節(jié)中的主要作用,并首次利用組織化學方法直觀地展示了蛋白水平上Rcan2兩種剪切變體在小鼠胚胎和成體中樞神經(jīng)系統(tǒng)的表達分布情況。本研究為進一步闡明Rcan2調(diào)控體重的機制提供了新的依據(jù)。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R589.2

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本文編號：2447092