【摘要】：目的:隨著人口老齡化、飲食結(jié)構(gòu)以及生活方式的改變,糖尿病發(fā)病率逐年升高,預(yù)計到2030年全球糖尿病患者將增加至3.66億。糖尿病腎病(diabetic nephropathy,DN)是糖尿病最常見、最嚴(yán)重的慢性微血管并發(fā)癥之一,隨著糖尿病發(fā)病率的升高,糖尿病腎病患者也越來越多,目前已成為我國導(dǎo)致終末期腎功能衰竭的主要原因之一,給家庭和社會帶來了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和精神壓力,嚴(yán)重影響著人們健康。進(jìn)一步揭示糖尿病腎病的發(fā)生、發(fā)展機(jī)制,探索防止或延緩病變進(jìn)展的有效措施是國內(nèi)外腎臟病學(xué)界熱切關(guān)注的重要課題。糖尿病腎病的病因復(fù)雜,涉及多種機(jī)制,包括糖代謝紊亂、血流動力學(xué)改變、氧化應(yīng)激與炎癥損傷、細(xì)胞因子和遺傳背景等。糖尿病腎病的主要臨床表現(xiàn)為蛋白尿和進(jìn)行性腎功能減退;其腎臟病理表現(xiàn)主要為腎小球系膜基質(zhì)積聚、基底膜(GBM)增厚引起結(jié)節(jié)狀或彌漫性腎小球硬化以及腎小管-間質(zhì)纖維化。足細(xì)胞是腎小球濾過屏障的重要組成部分,足細(xì)胞損傷是蛋白尿的病理基礎(chǔ),是糖尿病腎病發(fā)生、發(fā)展過程中的重要環(huán)節(jié),但迄今其發(fā)生機(jī)制尚未明確。自噬是溶酶體介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)蛋白和細(xì)胞器等物質(zhì)的降解過程,是存在于真核生物細(xì)胞中的一種高度保守的保護(hù)性機(jī)制,對穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)環(huán)境、維持細(xì)胞的存活具有重要意義。目前研究發(fā)現(xiàn),足細(xì)胞具有高水平的基礎(chǔ)自噬活性,在高糖環(huán)境中,細(xì)胞信號通路發(fā)生改變,使細(xì)胞自噬功能受損,不能對各種應(yīng)激產(chǎn)生保護(hù)性反應(yīng),且加重細(xì)胞器功能的紊亂和結(jié)構(gòu)破壞,最終導(dǎo)致疾病的發(fā)生。足細(xì)胞自噬參與糖尿病腎病發(fā)生的機(jī)制研究已成為該領(lǐng)域的熱點(diǎn)課題。此外,長期微炎癥狀態(tài)是糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素,不同途徑激活的炎癥機(jī)制參與了糖尿病腎病的病理生理。Toll樣受體(TLRs)可在足細(xì)胞中表達(dá),通過調(diào)控下游核因子κB(NF-κB)等信號分子的表達(dá),激活炎癥反應(yīng)。已知TLRs信號通路的兩條途徑的關(guān)鍵因子分別為:髓樣分化因子介導(dǎo)的88(My D88)接頭蛋白,Toll樣受體(TIR)適配器誘導(dǎo)干擾素β結(jié)構(gòu)域的(TRIF)銜接蛋白。目前關(guān)于TLRs/NF-κB信號通路在糖尿病腎病發(fā)病機(jī)制中已有基礎(chǔ)研究,但具體涉及到兩個關(guān)鍵因子在糖尿病腎病中的具體表現(xiàn)少有描述。金雀異黃素(GEN)是從大豆中提純的大豆異黃酮的主要組分。目前的基礎(chǔ)研究表明,GEN能緩解糖尿病小鼠腎臟氧化應(yīng)激、炎癥和纖維化程度,發(fā)揮腎臟保護(hù)作用,但其作用機(jī)制并不明確。本研究我們應(yīng)用生理濃度的GEN對高糖環(huán)境下小鼠足細(xì)胞自噬的影響作用進(jìn)行了觀察,同時也分析了GEN對TLRs/NF-κB信號傳導(dǎo)通路和其中的相關(guān)炎癥因子的干預(yù)機(jī)制,旨在探討GEN在糖尿病腎病發(fā)生發(fā)展中的干預(yù)作用,為臨床治療提供實驗性理論研究。方法：1 GEN對高糖環(huán)境下足細(xì)胞自噬的影響條件性永生化小鼠足細(xì)胞在33℃,γ-IFN存在的條件下培養(yǎng)傳代后,于37℃,無γ-IFN的條件下培養(yǎng)10-14天,使細(xì)胞分化成熟。免疫熒光化學(xué)檢測synaptopodin觀察足細(xì)胞成熟情況。未分化成熟的足細(xì)胞不表達(dá)synaptopodin,合格的細(xì)胞被用于實驗。①首先探究高糖環(huán)境足細(xì)胞自噬的最佳時間。不同時間點(diǎn)應(yīng)用高糖培養(yǎng)成熟小鼠足細(xì)胞0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h,應(yīng)用western blot檢測微管相關(guān)蛋白3(microtubule Associated Protein Light Chain 3,LC3Ⅱ)確定高糖環(huán)境足細(xì)胞自噬的最佳時間。②在GEN(20μM)和時間(6h)條件下,分別設(shè)置正常糖組(5.5 m M,Normal glucose,NG)、甘露醇對照組(5.5 m M glucose+24.5 m M mannitol,MC)、高糖組(30 m M,High glucose,HG)、高糖+GEN組(30 m M HG+0.05%DMSO+20μM genistein,G)、高糖+自噬抑制劑(氯喹)組(30m M HG+1μM chloroquine,CQ)和高糖+氯喹+GEN組(30 m M HG+1μM CQ+0.05%DMSO+20μM GEN,CG),應(yīng)用電鏡觀察自噬小體。③設(shè)置對照如上,應(yīng)用免疫熒光化學(xué),直觀分析LC3和磷酸化雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,p-m TOR)的表達(dá)。④應(yīng)用western blot檢測LC3Ⅱ、p-m TOR的蛋白表達(dá),應(yīng)用western blot和real-time PCR方法檢測nephrin的蛋白和基因水平,評估GEN對高糖環(huán)境足細(xì)胞自噬的影響。2 GEN對高糖環(huán)境下足細(xì)胞TLRs/NF-κB通路的干預(yù)作用①首先探究高糖環(huán)境足細(xì)胞NF-κB p65表達(dá)的最佳時間。不同時間點(diǎn)應(yīng)用高糖培養(yǎng)成熟小鼠足細(xì)胞0h、2h、6h、12h、24h、48h、72h,應(yīng)用western blot檢測NF-κB p65確定高糖環(huán)境足細(xì)胞NF-κB p65表達(dá)的最佳時間。②在GEN(20μM)和時間(48h)條件下,分別設(shè)置正常糖組(5.5 m M,Normal glucose,NG)、甘露醇對照組(5.5 m M glucose+24.5m M mannitol,MC)、高糖組(30 m M,High glucose,HG)和高糖+GEN組(30 m M HG+0.05%DMSO+20μM GEN,G),應(yīng)用免疫熒光化學(xué),直觀分析核因子κB(nuclear factor kappa B,NF-κB p65)的表達(dá)。③設(shè)置組如上,應(yīng)用western blot,檢測My D88、TRIF和NF-κB p65的蛋白表達(dá),應(yīng)用ELISA檢測單核細(xì)胞趨化蛋白-1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-l)。④應(yīng)用western blot和real-time PCR方法檢測nephrin的蛋白和基因水平,評估GEN對高糖環(huán)境足細(xì)胞內(nèi)TLRs/NF-κB通路中的關(guān)鍵因子的干預(yù)作用,以及對足細(xì)胞的影響。3 GEN對高糖環(huán)境下My D88/TRIF基因敲減足細(xì)胞自噬的影響①優(yōu)化轉(zhuǎn)染條件,找出化學(xué)合成的si RNA沉默My D88/TRIF基因表達(dá)的最佳劑量。②將分化成熟的小鼠足細(xì)胞分為高糖組(HG)、高糖+對照si RNA組(HG+con.si RNA,HC)、高糖+My D88-si RNA組(HG+My D88-si RNA,M)、高糖+My D88-si RNA+GEN組(HG+My D88-si RNA+0.05%DMSO+20μM GEN,MG)組、高糖+TRIF-si RNA組(HG+TRIF-si RNA,T)、高糖+TRIF-si RNA+GEN組(HG+TRIF-si RNA+0.05%DMSO+20μM GEN,TG)、高糖+My D88-si RNA+TRIF-si RNA組(HG+My D88-si RNA+TRIF-si RNA,MT)和高糖+My D88-si RNA+TRIF-si RNA+GEN組(HG+My D88-si RNA+TRIF-si RNA+0.05%DMSO+20μM GEN,MTG)。經(jīng)培養(yǎng)6h,應(yīng)用免疫熒光化學(xué),直觀分析LC3和p-m TOR表達(dá)。③設(shè)置對照如上,應(yīng)用western blot檢測LC3Ⅱ和p-m TOR的蛋白表達(dá),應(yīng)用western blot和real-time PCR方法檢測nephrin的蛋白和基因水平,評估基因敲減My D88/TRIF后GEN對高糖環(huán)境足細(xì)胞自噬的影響。4 GEN對高糖環(huán)境下My D88/TRIF基因敲減足細(xì)胞TLRs/NF-κB通路的干預(yù)作用將分化成熟的小鼠足細(xì)胞分為高糖組(HG)、高糖+對照si RNA組(HG+con.si RNA,HC)、高糖+My D88-si RNA組(HG+My D88-si RNA,M)、高糖+My D88-si RNA+GEN組(HG+My D88-si RNA+0.05%DMSO+20μM GEN,MG)組、高糖+TRIF-si RNA組(HG+TRIF-si RNA,T)、高糖+TRIF-si RNA+GEN組(HG+TRIF-si RNA+0.05%DMSO+20μM GEN,TG)、高糖+My D88-si RNA+TRIF-si RNA組(HG+My D88-si RNA+TRIF-si RNA,MT)和高糖+My D88-si RNA+TRIF-si RNA組+GEN組(HG+My D88-si RNA+TRIF-si RNA+0.05%DMSO+20μM GEN,MTG)。①經(jīng)培養(yǎng)48h,應(yīng)用免疫熒光化學(xué),直觀分析NF-κB p65的表達(dá)。②應(yīng)用western blot,檢測My D88、TRIF的蛋白表達(dá),應(yīng)用ELISA檢測MCP-1。③應(yīng)用western blot和real-time PCR方法檢測nephrin的蛋白和基因水平,評估GEN對高糖環(huán)境足細(xì)胞內(nèi)TLRs/NF-κB通路中的關(guān)鍵因子的干預(yù)作用,以及對足細(xì)胞的影響。結(jié)果：1 GEN對高糖環(huán)境下足細(xì)胞自噬的影響①33℃時的條件永生化小鼠足細(xì)胞,F-actin免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示,細(xì)胞形狀呈梭形或三角形,突起較少。Synaptopodin免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示,細(xì)胞胞漿中幾乎不表達(dá)。37℃經(jīng)培養(yǎng)10-14天后的足細(xì)胞,F-actin免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示,細(xì)胞胞漿向四周展開,突起增多。Synaptopodin免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示,細(xì)胞胞漿中表達(dá)明顯增強(qiáng)。②高糖環(huán)境足細(xì)胞自噬的時效關(guān)系實驗結(jié)果顯示:在高糖培養(yǎng)足細(xì)胞6h,LC3Ⅱ表達(dá)顯著(P0.01)。③電鏡觀察結(jié)果:在NG組和HG組均存在自噬小體,HG組中自噬小體較NG組偏多。④免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示:LC3在HG組、G組、CQ組和CG組表達(dá)均比較明顯。p-m TOR在HG組、G組表達(dá)偏弱,CQ組表達(dá)上調(diào)。⑤western blot結(jié)果顯示:LC3Ⅱ在各組均有表達(dá),LC3Ⅱ在HG組、G組、CQ組和CG組表達(dá)更為明顯(P0.01)。p-m TOR在HG組、G組表達(dá)下調(diào)(P0.05),在CQ組表達(dá)水平偏高(P0.01)。⑥nephrin的western blot和Real-time PCR檢測結(jié)果顯示:nephrin在HG組表達(dá)下降(P0.01),CQ組較CG組表達(dá)下調(diào)(P0.01)。2 GEN對高糖環(huán)境下足細(xì)胞TLRs/NF-κB通路的干預(yù)作用①高糖環(huán)境足細(xì)胞NF-κB p65表達(dá)的時效關(guān)系實驗結(jié)果顯示:在高糖培養(yǎng)足細(xì)胞48h,NF-κB p65的核轉(zhuǎn)移表達(dá)顯著(P0.05)。②免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示:NG和G組NF-κB p65主要在細(xì)胞胞漿中表達(dá),HG組NF-κB p65主要在細(xì)胞胞核中表達(dá)。③western blot結(jié)果顯示:My D88、TRIF在HG組較NG組表達(dá)上調(diào)(P0.01),NF-κB p65的核蛋白表達(dá)在HG組較NG組顯著(P0.01)。④Nephrin的western blot和real-time PCR結(jié)果顯示:NG組和G組中表達(dá)顯著高于HG組。⑤ELISA檢測結(jié)果顯示:MCP-1在HG組較NG組和G組表達(dá)上調(diào)(P0.01)。3 GEN對高糖環(huán)境下My D88/TRIF基因敲減足細(xì)胞自噬的影響①M(fèi)y D88-si RNA和TRIF-si RNA驗證實驗結(jié)果:My D88-si RNA和TRIF-si RNA能夠顯著敲減高糖環(huán)境足細(xì)胞My D88/TRIF蛋白和m RNA的表達(dá)。證實在6孔板中以70 pmol/孔轉(zhuǎn)染足細(xì)胞敲減效果最好。②免疫熒光化學(xué)結(jié)果顯示,LC3在MT組較其他組在胞漿表達(dá)較弱,MTG組較MT組表達(dá)上調(diào)。p-m TOR結(jié)果與其相反。③應(yīng)用western blot檢測LC3Ⅱ、p-m TOR和nephrin的蛋白表達(dá)結(jié)果:與HG組相比,LC3II在T組無明顯變化(P0.05),在M組、MT組表達(dá)下降(P0.05);p-m TOR在M組、T組和MT組表達(dá)明顯升高(P0.01)。與M組相比,LC3II和nephrin在MG組表達(dá)明顯上調(diào)(P0.01);p-m TOR在MG組表達(dá)明顯下降(P0.01)。與T組相比,LC3II和nephrin在TG組表達(dá)明顯上調(diào);p-m TOR在TG組表達(dá)下降(P0.05)。與MT組相比,LC3II和nephrin在MG組表達(dá)明顯上調(diào)(P0.01);p-m TOR在MG組表達(dá)明顯下降(P0.01)。④應(yīng)用real-time PCR方法檢測nephrin的基因水平,與HG組相比,nephrin在M組和T組無明顯差異(P0.05),M組水平偏高(P0.05),MG組、TG組和MTG組表達(dá)明顯偏高(P0.01)。4 GEN對高糖環(huán)境下My D88/TRIF基因敲減足細(xì)胞TLRs/NF-κB通路的干預(yù)作用①免疫熒光化學(xué)結(jié)果:與HG和HC組相比,M組、T組和MT組中NF-κB p65在細(xì)胞核內(nèi)表達(dá)明顯減弱,以MT組表達(dá)最弱。加用GEN組中NF-κB p65在細(xì)胞漿表達(dá)相對明顯。②ELISA檢測MCP-1結(jié)果:與HG和HC組相比,M組、T組和MT組表達(dá)下調(diào),GEN治療組下調(diào)更為明顯(P0.01)。③應(yīng)用western blot檢測NF-κB p65和nephrin結(jié)果示:與HG組相比,nucleus NF-κB p65在M組、T組和MT組表達(dá)下降(P0.01);nephrin在在M組、T組和MT組表達(dá)升高。與M組相比,nucleus NF-κB p65在MG組表達(dá)明顯下降(P0.01);nephrin在MG組表達(dá)明顯升高(P0.01)。與T組相比,nucleus NF-κB p65在TG組表達(dá)明顯下降(P0.01);nephrin在MG組表達(dá)明顯升高(P0.01)。與MT組相比,nucleus NF-κB p65在MTG組中無明顯變化(P0.05);nephrin在MTG組表達(dá)明顯升高(P0.01)。④應(yīng)用real-time PCR方法檢測nephrin結(jié)果:與HG組和HC組相比,敲減基因My D88/TRIF和應(yīng)用GEN都可使nephrin表達(dá)上調(diào)(P0.01)。⑤ELISA檢測結(jié)果顯示:與HG組相比,MCP-1在其他組均明顯下調(diào)。(P0.01)。結(jié)果：1在高糖刺激早期,GEN可通過促進(jìn)細(xì)胞自噬發(fā)揮對足細(xì)胞的保護(hù)作用。2在高糖刺激晚期,GEN具有足細(xì)胞抗炎保護(hù)作用,其作用機(jī)制可能是通過抑制TLRs/NF-κB信號通路減輕足細(xì)胞炎癥損傷所致。3在高糖刺激早期,GEN可減輕TLRs/NF-κB信號通路阻斷后自噬的下降程度。4 GEN干預(yù)TLRs/NF-κB信號通路從早期抑制My D88開始,后期也對TRIF有抑制作用。而且在高糖刺激晚期,除了干預(yù)TLRs/NF-κB信號通路,GEN對足細(xì)胞的保護(hù)作用,還應(yīng)包括其他機(jī)制。綜上,本研究提示GEN在糖尿病足細(xì)胞的自噬和炎癥損傷中發(fā)揮了作用,可促進(jìn)足細(xì)胞自噬,抑制TLRs/NF-κB通路活化,對高糖培養(yǎng)小鼠足細(xì)胞有保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2

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本文編號：2388027