【摘要】：目的:類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis,RA)是以關(guān)節(jié)滑膜炎、血管翳的形成、軟骨及骨侵蝕破壞為主要病理改變的一種病因尚未明確的慢性炎癥性自身免疫系統(tǒng)疾病。隨著對RA疾病研究的深入,發(fā)現(xiàn)RA成纖維樣滑膜細(xì)胞(RA-FLS)遷移及侵襲能力的增強在RA的發(fā)病機制中起重要作用。血小板微顆粒(Platelet microparticles,PMPs)是血小板活化后脫落的胞膜顆粒。本課題組前期工作及文獻報道顯示RA患者外周血與關(guān)節(jié)腔中PMPs均異常增高,且PMPs的水平與RA疾病活動性相關(guān),提示PMPs在RA的疾病的發(fā)生及發(fā)展中起一定作用。我們前期工作已發(fā)現(xiàn)PMPs可通過激活NF-κB通路,上調(diào)RA-FLS中MMP1的表達(dá),進而促進了 RA-FLS遷移及侵襲。本研究的目的是明確PMPs中促進RA-FLS遷移、侵襲的主要活性成份,并探究其作用機制。方法:1.培養(yǎng)人類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎成纖維樣滑膜細(xì)胞(MH7A),采用流式細(xì)胞儀以FITC標(biāo)記的鼠抗人CD90、PE標(biāo)記的鼠抗人CD55抗體進行細(xì)胞鑒定。2.選取新鮮機采富血小板血漿,使用ADP活化血小板,提取PMPs,并使用流式細(xì)胞儀以PE標(biāo)記的鼠抗人CD41抗體進行純度測定,進行定量。3.通過蛋白質(zhì)譜分析PMPs中的主要成分。4.應(yīng)用CCK-8試劑盒檢測各種趨化因子受體拮抗劑對RA-FLS細(xì)胞活力的影響。5.利用細(xì)胞劃痕、Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實驗探究各種趨化因子受體拮抗劑對PMPs誘導(dǎo)的RA-FLS遷移、侵襲能力的影響。6.通過高通量基因芯片檢測PMPs對RA-FLS中相關(guān)基因表達(dá)的影響。使用RT-qPCR從mRNA水平、Western Blot從蛋白水平驗證基因芯片的結(jié)果。7.使用Western Blot方法研究PMPs促進RA-FLS遷移、侵襲的主要活性成份及其作用機制。研究結(jié)果:1.流式細(xì)胞儀鑒定MH7A的CD90、CD55的陽性表達(dá)率為95.6±1.36%(n=3),確定其性質(zhì),可用于后期實驗。2.流式細(xì)胞儀鑒定,提取的PMPs純度達(dá)93.4± 1.46%(n=3),可用于后期實驗。3.PMPs蛋白組學(xué)分析結(jié)果顯示PMPs中含有5256種蛋白,GO分析表明這些蛋白質(zhì)涉及到生物學(xué)過程、細(xì)胞組成、分子功能和信號通路等方面。PMPs中含有多種與細(xì)胞遷移及侵襲相關(guān)的趨化因子,如CCL5、CCL23、CXCL4及CXCL7等。4.CCK-8細(xì)胞活力檢測實驗結(jié)果表明實驗選擇的受體拮抗劑BX471(CCR1拮抗劑)、AMG487(CXCR3 拮抗劑)、STI571(CXCR3 拮抗劑)、SB225002(CXCR2 拮抗劑)對細(xì)胞活力均無明顯影響(P0.05)。5.細(xì)胞劃痕、Transwell細(xì)胞遷移實驗表明BX471、AMG 487、STI571對PMPs促進RA-FLS遷移的作用無明顯影響(P0.05);SB225002具有部分阻斷PMPs促進RA-FLS遷移的作用(P0.05)。6.Transwell細(xì)胞侵襲實驗表明SB225002具有部分阻斷PMPs促進RA-FLS侵襲的作用(P0.05)。7.高通量基因芯片檢測顯示25 μgml及50μg/ml PMPs明顯上調(diào)了 RA-FLS中CXCL5的mRNA的表達(dá)。RT-qPCR、Western Blot檢測證實PMPs可上調(diào)RA-FLS中CXCL5的表達(dá)(P0.05)。8.Western Blot 實驗結(jié)果顯示 SB225002 可下調(diào) RA-FLS 中 p-IκB、p-NF-κB(P0.05);PMPs 一方面可以下調(diào)RA-FLS中IκB的表達(dá),另一方面可以上調(diào)RA-FLS中p-IκB的表達(dá),而SB225002+50 μg/ml PMPs組與50 μg/ml PMPs組相比上調(diào)RA-FLS中IκB的表達(dá),且下調(diào) RA-FLS 中 p-IκB 的表達(dá)(P0.05);PMPs 可上調(diào) RA-FLS 中 p-NF-κB 的表達(dá),SB225002+50 μg/ml PMPs組與50μg/ml PMPs組相比RA-FLS中p-NF-Kb的表達(dá)明顯減少(P0.05),提示SB225002可拮抗PMPs活化RA-FLS中IκB、NF-κB的作用。結(jié)論:1.CXCR2拮抗劑(SB225002)不僅可以抑制RA-FLS的遷移及侵襲,而且可以抑制PMPs誘導(dǎo)的RA-FLS的遷移及侵襲。2.PMPs可通過CXCR2介導(dǎo)的信號途徑激活NF-κB通路促進RA-FLS的遷移及侵襲。
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【學(xué)位授予單位】：揚州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R593.22
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本文編號：2379857