【摘要】：背景:類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)是一種以滑膜炎及血管翳形成為主要病理特征的慢性系統(tǒng)性自身免疫性疾病,其致殘率高。以甲氨蝶呤(methotrexate,MTX)為代表的改善病情抗風(fēng)濕藥(disease-modifying anti-rheumatic drugs,DMARDs)藥物是RA治療的首選藥物,但臨床上存在多藥耐藥現(xiàn)象(multiple drug resistance,MDR)。多藥耐藥基因1(MDR1)編碼的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)可介導(dǎo)藥物排出增加,這被認(rèn)為可能是多藥耐藥性產(chǎn)生的關(guān)鍵機(jī)制。最新研究發(fā)現(xiàn),RA致病機(jī)制中的關(guān)鍵因子-白介素-6(Interleukin-6,IL-6)及其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在MDR產(chǎn)生中發(fā)揮重要作用。但是RA滑膜成纖維細(xì)胞(fibroblast-like synocytes,FLS)上,IL-6對P-gp的調(diào)控作用如何,MTX耐藥現(xiàn)象與P-gp具體機(jī)制相關(guān)研究甚少。本文通過建立滑膜成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系,研究IL-6對RA-FLS上P-gp的調(diào)控作用,比較分析MTX單藥及MTX聯(lián)合小劑量CTX兩種療法在誘導(dǎo)耐藥蛋白P-gp方面的差別及其具體機(jī)制。目的:通過檢測RA患者滑膜細(xì)胞上P-gp及JAK2-STAT3信號(hào)通路蛋白的水平,分析不同濃度IL-6、MTX單藥和MTX聯(lián)合小劑量CTX兩種治療方案誘導(dǎo)P-gp水平的差異及其可能參與的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,明確IL-6對FLS上P-gp的調(diào)控作用及信號(hào)通路,進(jìn)而探討MTX聯(lián)合CTX逆轉(zhuǎn)RA患者多藥耐藥性的具體機(jī)制。方法:通過細(xì)針滑膜穿刺活檢術(shù)提取3例RA初治患者滑膜組織,探索建立滑膜成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)體系,培養(yǎng)至V代左右進(jìn)行實(shí)驗(yàn):第一部分,IL-6對RA-FLS P-gp表達(dá)的影響及機(jī)制研究:(1)不同濃度IL-6對RA-FLS P-gp表達(dá)水平的影響研究:將FLS分為A、B、C、D 4組,分別加入不同處理:A組為細(xì)胞對照組,B組加入低濃度的IL-6(4ng/ml),C組加入中濃度IL-6(20ng/ml),D組加入高濃度IL-6(100ng/ml),觀察不同濃度IL-6對P-gp表達(dá)水平的影響;(2)IL-6調(diào)控FLS P-gp過程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路研究:將FLS分為A、B、C、D 4組,分別加入不同處理:A組為細(xì)胞對照組,B組加入IL-6(100ng/ml),C組、D組分別加入JAK2-STAT3通路抑制劑AG490(50μmol/L)、ERK1/2通路抑制劑PD98059(20μmol/L)預(yù)處理30分鐘后,再加入IL-6(100ng/ml),觀察參與IL-6調(diào)控P-gp過程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路;第二部分,MTX±CTX對RA-FLS P-gp的影響及其機(jī)制研究:將FLS分為A、B、C、D、E 5組,分別加入不同處理:A組為細(xì)胞對照組,B、C組分別加入MTX(0.01μg/ml)、MTX(0.01μg/ml)+CTX(1μg/ml),D、E組加入AG490(50μmol/L)預(yù)處理30分鐘后,再分別加入MTX、MTX+CTX,觀察MTX±CTX對P-gp表達(dá)的影響,研究參與MTX±CTX調(diào)控P-gp過程的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。將處理好的FLS放置于37℃C02恒溫培養(yǎng)箱中,飽和濕度下培養(yǎng)72小時(shí)后收集細(xì)胞,行流式細(xì)胞術(shù)檢測滑膜細(xì)胞膜蛋白P-gp表達(dá)水平,RT-PCR方法檢測滑膜細(xì)胞P-gp、JAK2、STAT3 m RNA的合成水平,Cell-based ELISA技術(shù)檢測滑膜細(xì)胞p-STAT3的蛋白水平,MTT實(shí)驗(yàn)觀察滑膜細(xì)胞抑制率,分析IL-6、藥物、通路抑制劑對RA患者滑膜細(xì)胞P-gp的影響。結(jié)果:1、與對照組相比,各IL-6濃度組的P-gp表達(dá)增加,P-gp m RNA合成增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其他各組之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);比較各組細(xì)胞抑制率,IL-6高濃度組細(xì)胞抑制率高于IL-6低濃度組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其他各組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);2、與對照組相比,IL-6組P-gp表達(dá)增加,P-gp m RNA合成增多,JAK2、STAT3m RNA合成水平、p-STAT3蛋白水平增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與IL-6組相比,AG490+IL-6組及PD98059+IL-6組P-gp的表達(dá)均有下降,P-gp m RNA合成均減少;AG490+IL-6組和PD98059+IL-6組相比,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,AG490+IL-6組P-gp下降趨勢更明顯(P0.05);與IL-6組相比,AG490+IL-6組的JAK2、STAT3m RNA合成水平、p-STAT3蛋白水平均有下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);比較各組細(xì)胞抑制率,兩兩比較細(xì)胞抑制率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);3、與對照組相比,各藥物組P-gp表達(dá)增加,P-gp m RNA合成增多,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與MTX組相比,MTX+CTX組P-gp表達(dá)較少,P-gp m RNA合成較少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);加入通路抑制劑進(jìn)行預(yù)處理后,P-gp表達(dá)較無通路抑制劑組降低,P-gp m RNA合成減少,JAK2、STAT3 m RNA合成水平、p-STAT3蛋白水平亦下降,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);比較各組細(xì)胞抑制率,兩兩比較細(xì)胞抑制率無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。結(jié)論:1、IL-6上調(diào)RA-FLS P-gp表達(dá),有一定濃度依賴性;2、IL-6上調(diào)RA-FLS P-gp表達(dá)過程中有JAK2-STAT3和ERK1/2通路的參與,以JAK2-STAT3通路為著;3、MTX或MTX聯(lián)合CTX均可通過JAK2-STAT3通路上調(diào)RA-FLS P-gp表達(dá);4、MTX聯(lián)合CTX可削弱MTX單藥對JAK2-STAT3通路的激活作用,進(jìn)而一定程度上逆轉(zhuǎn)P-gp表達(dá)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R593.22

【參考文獻(xiàn)】

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2 Shizuyo Tsujimura;Yoshiya Tanaka;;Disease control by regulation of P-glycoprotein on lymphocytes in patients with rheumatoid arthritis[J];World Journal of Experimental Medicine;2015年04期

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本文編號(hào)：2372389