發(fā)布時間：2018-12-08 08:12

【摘要】：骨質(zhì)疏松癥是一種以骨量降低,骨微結(jié)構(gòu)破壞,導(dǎo)致骨脆性和骨折發(fā)生率增高的全身性骨病。絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥是骨質(zhì)疏松癥中最為常見的類型,它的顯著特征表現(xiàn)為高骨轉(zhuǎn)換型,即骨吸收與骨生成均處于活躍狀態(tài)。目前全世界2億多骨質(zhì)疏松癥患者中約有33%為絕經(jīng)后婦女,而治療骨質(zhì)疏松癥的藥物副作用較大,因此需要尋找安全有效的抗骨質(zhì)疏松活性物質(zhì)。南極磷蝦含有豐富的優(yōu)質(zhì)蛋白,蛋白質(zhì)磷酸化是提高蛋白質(zhì)功能的一種有效手段,磷酸基的導(dǎo)入會促進(jìn)生物體對鈣的吸收,但對于磷酸化蛋白改善骨質(zhì)疏松的研究尚無報道。從南極磷蝦蛋白中制備的南極磷蝦肽具有多種生物活性,但關(guān)于磷酸化南極磷蝦肽(phosphorylated peptides from Antarctic krill, PP-AKP)在抗骨質(zhì)疏松活性方面的研究未見報道。因此,本論文采用雙側(cè)去卵巢手術(shù)建立骨質(zhì)疏松癥大鼠模型,系統(tǒng)研究了PP-AKP對骨質(zhì)疏松癥的改善作用,并闡明了其可能的作用機(jī)制,主要研究結(jié)果如下：從南極磷蝦中制備的PP-AKP,其分子量范圍為200-2000Da,蛋白含量為90.71%,磷含量為1.52%,氟含量為2.49ppm(符合食品安全國家標(biāo)準(zhǔn))。模型大鼠灌胃PP-AKP 90d后,其血液、尿液生化指標(biāo)結(jié)果顯示,PP-AKP能顯著降低模型大鼠血清中BALP活性和OCN、PICP含量,增加OPG含量,降低RANKL含量,降低RANKL/OPG比值,調(diào)控模型大鼠骨生成,抑制高骨轉(zhuǎn)換速率,抑制骨吸收；PP-AKP能顯著降低血清中TRACP、Cath-K活性和CTX-1含量,降低尿液中DPD、Ca、 P含量,抑制模型大鼠骨吸收,抑制膠原和礦物質(zhì)的丟失。炎癥因子能通過誘導(dǎo)破骨細(xì)胞前體細(xì)胞分化成破骨細(xì)胞,介導(dǎo)骨吸收。實驗結(jié)果顯示, PP-AKP能顯著降低模型大鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、NO含量和COX-2活性,抑制模型大鼠骨吸收。提示PP-AKP能顯著抑制模型大鼠的高骨轉(zhuǎn)換狀態(tài),抑制骨吸收。骨密度是診斷骨質(zhì)疏松癥的金指標(biāo)。骨生物力學(xué)是全面評價骨質(zhì)量,預(yù)測骨折發(fā)生的關(guān)鍵指標(biāo)。實驗結(jié)果顯示,PP-AKP能顯著增加模型大鼠股骨和脛骨骨密度,增加模型大鼠脛骨最大載荷和結(jié)構(gòu)強(qiáng)度,提高生物力學(xué)性能。股骨組織學(xué)分析進(jìn)一步顯示,PP-AKP能顯著增加骨小梁數(shù)目,增加骨小梁面積,降低骨小梁間距,修復(fù)骨組織網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),維持較高的骨連接。提示PP-AKP能提高模型大鼠的骨強(qiáng)度,減少骨折發(fā)生。成骨細(xì)胞在骨質(zhì)疏松中起關(guān)鍵作用,它不僅介導(dǎo)骨生成,而且調(diào)控破骨細(xì)胞介導(dǎo)的骨吸收。其中經(jīng)典的Wnt/β-catenin信號通路是成骨細(xì)胞介導(dǎo)骨生成的主要通路。qRT-PCR結(jié)果顯示,PP-AKP能顯著下調(diào)模型大鼠股骨Wnt/β-catenin信號通路中關(guān)鍵基因LRP-5b, β-catenin、RUNX2、 OSX mRNA的表達(dá),顯著下調(diào)COLI、OCN、ALP等成骨細(xì)胞功能相關(guān)基因mRNA的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示,PP-AKP能顯著抑制模型大鼠股骨LRP-5b、總β-catenin、核P-catenin、 RUNX2等蛋白的表達(dá)。提示PP-AKP通過下調(diào)Wnt/p-catenin信號通路,調(diào)控模型大鼠的骨生成,抑制模型大鼠高骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)。OPG/RANKL/RANK通路在成骨細(xì)胞調(diào)控破骨細(xì)胞活性和功能方面起重要作用。NF-κB和MAPKs信號通路的激活是OPG/RANKL/RANK信號通路傳遞的特征標(biāo)志。qRT-PCR結(jié)果顯示,PP-AKP能顯著上調(diào)模型大鼠股骨OPG mRNA的表達(dá),顯著下調(diào)RANKL mRNA的表達(dá),對RANK mRNA的表達(dá)無顯著影響；顯著下調(diào)NF-κB通路中關(guān)鍵基因TRAF6、 NF-κB、 c-fos和NFATC1 mRNA的表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示,PP-AKP能顯著上調(diào)模型大鼠股骨OPG的蛋白表達(dá),顯著下調(diào)RANKL、 TRAF6、 NFATC1的蛋白表達(dá),顯著下調(diào)P-NF-κB的蛋白表達(dá)水平,但對NF-κB總蛋白的表達(dá)無顯著影響。提示PP-AKP能抑制OPG/RANKL/NF-κB信號通路的激活。另外,PP-AKP顯著下調(diào)MAPKs通路中p38、 ERK、 JNK等mRNA的表達(dá),顯著下調(diào)p-p38的蛋白表達(dá),但對p38總蛋白的表達(dá)無顯著影響。提示PP-AKP能抑制OPG/RANKL/MAPKs信號通路的激活。Cath-K、 MMP-9和TRACP是破骨細(xì)胞吸收功能的標(biāo)志性指標(biāo)。結(jié)果顯示,PP-AKP能顯著抑制Cath-K、 MMP-9和TRACP mRNA的表達(dá),顯著抑制Cath-K和MMP-9蛋白的表達(dá)。綜上結(jié)果顯示,PP-AKP能通過抑制OPG/RANKL/NF-κB和OPG/RANKL/MAPKs信號通路的激活,抑制破骨細(xì)胞的分化成熟,抑制模型大鼠的骨吸收。本論文首次證明了PP-AKP增加骨質(zhì)疏松癥大鼠骨密度的作用,并對其作用機(jī)制進(jìn)行了深入闡明,為南極磷蝦的高值化利用和新型抗骨質(zhì)疏松癥相關(guān)的營養(yǎng)品、功能食品、藥物等的開發(fā)提供了科學(xué)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國海洋大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R580

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本文編號：2368017