【摘要】：研究背景:系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus.SLE)多見(jiàn)于育齡期青年女性,病理變化以炎癥反應(yīng)、血管異常為主的慢性自身免疫性疾病。環(huán)境及遺傳因素、激素水平和免疫調(diào)節(jié)因子等多種機(jī)制參與了疾病的發(fā)生發(fā)展,固有免疫及適應(yīng)性免疫系統(tǒng)均在SLE發(fā)病過(guò)程中扮演重要角色。作為人體重要的免疫屏障系統(tǒng),固有免疫系統(tǒng)具有清除外來(lái)病原體和激活適應(yīng)性免疫應(yīng)答的作用。通過(guò)模式識(shí)別受體(pattern recognition receptors,PRRs),固有免疫系統(tǒng)識(shí)別病原體相關(guān)分子模式(pathogen associated molecular pattern,PAMP)發(fā)揮屏障作用。目 前,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的PRRs中,一些NOD樣受體(nucleotide binding oligome-rization domain-like receptors,NLRs)被激活后形成一種胞內(nèi)高分子蛋白復(fù)合體,稱為"炎性小體"或"炎癥小體"。炎性小體可以激活半胱天冬酶-1(cysteinyl aspartate-specific proteinase,Caspase-1),誘導(dǎo)白介素-]beta(interleukin-1 beta,IL-1b)、白介素18(interleukin-18,1L-18)的產(chǎn)生及活化,參與調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫、炎癥反應(yīng)。已報(bào)道的炎性小體主要有四種:Nod樣受體蛋白1(Nod-like receptor protein1,NLRP1)、Nod樣受體蛋白3(Nod-like receptorprotein3,NLRP3)、IPAF(ice-protease-activating factor,IPAF)及AIM2(absent in melanoma 2,AIM2),其中NLRP3炎性小體能夠被多種病原體激活,如細(xì)菌、病毒、代謝產(chǎn)物、結(jié)晶體等,是目前研究最廣泛的炎性小體。在本課題組先前的研究究中發(fā)現(xiàn)SLE患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中NLRP3炎性小體呈低表達(dá),且與疾病活動(dòng)呈負(fù)相關(guān),給予藥物治療后NLRP3炎性小體組分表達(dá)量顯著升高,提示其可能在SLE發(fā)病中起到保護(hù)性作用,但具體機(jī)制不詳。近期,研究發(fā)現(xiàn)NIMA相關(guān)蛋白激酶7(never in mitosis gene A related kinase7,NEK7),一種具有調(diào)控細(xì)胞周期、促進(jìn)細(xì)胞有絲分裂功能的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,是激活NLRP3炎性小體的關(guān)鍵蛋白。目的:探討NEK7-NLRP3炎性小體信號(hào)通路在SLE患者PBMC中的表達(dá)及其臨床意義。方法:選取2016年03月至2016年11月期間就診于山東大學(xué)附屬省立醫(yī)院風(fēng)濕免疫科的SLE患者38例(SLE組)及同期就診于該院查體中心的健康人33例(健康對(duì)照組)。采用實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(real-time Polymerase Chain Reaction,real-time PCR)法和免疫印跡試驗(yàn)(western blotting)檢測(cè)兩組研究對(duì)象PBMC中NEK7、NLRP3炎性小體各組分(NLRP3、ASC、Caspase-1)及下游因子IL-1b、IL-18的mRNA、蛋白表達(dá)量,酶聯(lián)免疫吸附法(enzyme-linked immunesorbent assay,ELISA)檢測(cè)其血清IL-1b、IL-18表達(dá)量。采用同種方法檢測(cè)25例治療后SLE患者上述指標(biāo)的表達(dá)量,分析治療前后相關(guān)組分的變化,探討其與SLE病情活動(dòng)評(píng)價(jià)指標(biāo)的相關(guān)性。結(jié)果:1.RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與健康對(duì)照組相比,SLE組PBMC中NEK7、NLRP3、ASCmRNA呈低表達(dá)(P=0.0004;P=0.0001;P=0.0005),而Caspase-1、IL-1b、IL-18 mRNA呈高表達(dá)(P=0.0001)。2.Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與健康對(duì)照組相比,SLE組PBMC中NEK7、NLRP3蛋白呈低表達(dá)(P=0.0317;P=0.0079),ASC蛋白表達(dá)無(wú)差異(P=0.8413),而Caspase-1、IL-1b、IL-18蛋白呈高表達(dá)(P=0.0159;P=0.009;P=0.016)。3.ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,SLE組血清IL-1b、1L-18表達(dá)量顯著高于健康對(duì)照組(P=0.000),治療后IL-1b、IL-18的表達(dá)水平明顯下降(P=0.000)。治療后SLE組血清IL-1b的表達(dá)量仍高于健康對(duì)照組(P=0.002),而治療后IL-18的表達(dá)量較健康對(duì)照組無(wú)明顯差異(P=0.495)。4.SLE組PBMC中NEK7、NIRP3炎性小體各組分及其下游細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量之間的相關(guān)分析4.1 SLE組PBMC中,NEK7與NLRP3、ASC mRNA表達(dá)量存在正相關(guān)(r=0.3728,P=0.0274;r=0.4454,P=0.0073),而與Caspase-1、IL-1b、IL-18 mRNA表達(dá)量無(wú)相關(guān)性(r=-0.2930,P=0.0876;r=0.06625,P=0.7053;r=-0.1063,P=0.5433)。4.2 SLE組PBMC中,NLRP3與ASC mRNA表達(dá)量存在正相關(guān)(r=0.7157,P=0.0001),而與Caspase-1、IL-1b、IL-18 mRNA表達(dá)量均無(wú)相關(guān)性(r=-0.1521,P=0.3831;r=0.05126,P=0.7699;r=0.1441,P=0.4088)。4.3SLE組PBMC中,ASCmRNA表達(dá)量與Caspase-1、IL-1b、IL-18mRNA表達(dá)量均無(wú)相關(guān)性(r=-0.2000,P=0.2494;r=-0.02479,P=0.8876;r=0.1583,P=0.3638)。4.4 SLE組PBMC中,Caspase-1 mRNA表達(dá)量與IL-1b、IL-18 mRNA表達(dá)量存在正相關(guān)(r=0.4790,P=0.0036;r=0.7090,P=0.0001);IL-1bmRNA表達(dá)量與IL-18mRNA表達(dá)量亦存在正相關(guān)(r=0.4996,P=0.0022)。5.SLE組PBMC中NEK7、NLRP3炎性小體各組分及其下游細(xì)胞因子mRNA表達(dá)量與SLE病情活動(dòng)評(píng)價(jià)指標(biāo)(抗ds-DNA抗體、抗AnuA抗體及SLEDAI評(píng)分)的相關(guān)分析5.1 SLE組PBMC中,NEK7 mRNA水平與抗AnuA抗體呈負(fù)相關(guān)(r=-0.5630,P=0.0006),與抗ds-DNA抗體、SLEDAI評(píng)分無(wú)相關(guān)性(r=-0.2701、-0.2692,P=0.1166、0.2034)。5.2 SLE組PBMC中,NLRP3 mRNA水平與抗ds-DNA抗體、抗AnuA抗體及SLEDAI評(píng)分均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.5453、-0.7087、-0.7430,P=0.0007、0.0001、0.0001)。5.3 SLE組PBMC中,ASC mRNA水平與抗ds-DNA抗體無(wú)相關(guān)性(r=-0.3261,P=0.0559),與抗AnuA抗體和SLEDAI評(píng)分呈負(fù)相關(guān)(r=-0.3722、-0.7667,P=0.0277、0.0001)。5.4 SLE組PBMC中,Caspase-1mRNA水平與抗ds-DNA抗體及SLEDAI評(píng)分無(wú)相關(guān)性(r=0.2281、0.1533,P=0.1876、0.3794),與抗AnuA抗體呈正相關(guān)(r=0.4361,P=0.0088)。5.5 SLE組PBMC中,IL-1bmRNA水平與抗ds-DNA抗體、抗AnuA抗體無(wú)相關(guān)性(r=-0.0230、0.1888,P=0.8956、0.2774),與SLEDAI評(píng)分呈正相關(guān)(r=0.7953,P=0.0001)。5.6 SLE組PBMC中,IL-18 mRNA水平與抗ds-DNA抗體、抗AnuA抗體及SLEDAI評(píng)分均呈正相關(guān)(r=0.4177、0.3498、0.5259,P=0.0125、0.0394、0.0012)。6.ELISA實(shí)驗(yàn)結(jié)果相關(guān)分析表明,SLE組血清IL-1b表達(dá)量與抗ds-DNA抗體、抗AnuA抗體、ESR 及SLEDAI 評(píng)分均呈正相關(guān)(r=0.584、0.504、0.566、0.624;P=0.002、0.010、0.003、0.001),與C3呈負(fù)相關(guān)(r=-0.398,P=0.049);SLE組血清IL-18表達(dá)量與抗ds-DNA抗體、ESR及SLEDAI評(píng)分亦呈正相關(guān)(r=0.544、0.512、0.612;P=0.005、0.009、0.010)。7.藥物治療后,SLE2組PBMC中NEK7、NLRP3 mRNA表達(dá)量較前升高:1.1189±0.5017 vs 2.4685±0.9712(P=0.025)、0.5726±0.1718 vs 0.9682±0.2675(P=0.024);ASC mRNA表達(dá)量治療前后未見(jiàn)明顯差異:1.0350±0.6351 vs 1.2686±0.8319(P=0.634);Caspase-1、IL-1b、IL-18 mRNA表達(dá)量治療后較治療前明顯降低:1.6419±0.3514vs0.7687±0.2223(P=0.002)、7.1753±2.2051 vs3.2899±1.3161(P=0.010)、3.3933± 0.8431vs 1.4175± 0.2151(P=0.001)。8.藥物治療后,SLE組PBMC中NEK7、NLRP3蛋白表達(dá)量較前升高:1.9415±0.4547 vs3.0900±0.8325(P=0.027)、0.5056± 0.3042 vs 1.0066± 0.2865(P=0.046);ASC蛋白表達(dá)量治療前后未見(jiàn)明顯差異:0.8152±0.2222 vs 0.9048±0.1032(P=0.437);Caspase-1、IL-1b及IL-18蛋白表達(dá)量較治療前顯著降低:2.4149±0.6172 vs 1.2169±0.3724(P=0.006)、4.0684±0.0855 vs 3.7134±0.1129(P=0.001)、2.7540±0.8599vs 2.5211±0.1986(P=0.043)。9.與SLE無(wú)腎損害組相比,LN組PBMC中NEK7、NLRP3、ASCmRNA呈低表達(dá):1.8173±0.7953 vs 1.0187±0.3036(P=0.002)、0.7432±0.2791 vs 0.4612±0.2317(P=0.004)、1.1426±0.4972 vs0.7455±0.2536(P=0.012);Caspase-1、IL-1b、IL-18 mRNA 呈高表達(dá):1.4763±0.5189 vs 2.5654±0.6]86(P=0.000)、3.0022±2.0904 vs 7.6056±4.7246(P=0.000)、2.6668±1.4962 vs 5.9491±3.3549(P=0.000)。10.與SLE無(wú)腎損害組相比,LN組PBMC中NEK7、NLRP3、ASC蛋白呈低表達(dá):2.4661±0.8916 vs 1.7945±0.9244(P=0.010)、0.8669±0.1290 vs 0.4779±0.1400(P=0.001)、1.1628±0.2963 vs 0.7191±0.1434(P=0.008);Caspase-1、IL-1b、IL-18 蛋白呈高表達(dá):2.1471±0.9455 vs 3.5734±0.9081(P=0.024)、3.1865±1.0688 vs4.8724±0.8605(P=0.013)、2.6391±0.4480 vs 3.8800±0.3223(P=0.000)。結(jié)論:1.NEK7-NLRP3復(fù)合體的低表達(dá)與SLE疾病活動(dòng)呈負(fù)相關(guān),可能作為保護(hù)性因素參與SLE、LN的發(fā)病。2.SLE患者PBMC中NEK7對(duì)NLRP3呈正性激活作用,NLRP3的低表達(dá)可能與其NEK7的低表達(dá)有關(guān)。3.SLE患者PBMC中Caspase-1的高表達(dá)與NEK7、NLRP3及ASC均無(wú)相關(guān)性,提示SLE患者PBMC中Caspase-1的表達(dá)不僅受NLRP3的作用,亦受其他信號(hào)通路的調(diào)控。4.SLE患者PBMC中Caspase-1過(guò)度活化介導(dǎo)的IL-1b、IL-18的成熟與釋放,參與了 SLE和LN的發(fā)病。
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【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R593.241

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本文編號(hào)：2347939