【摘要】：目的:糖脂代謝異常及其相關糖尿病和心血管疾病現(xiàn)已成為危害人類健康的主要原因,患者常表現(xiàn)為胰島素抵抗及血脂異常沉積,其中胰島β細胞和血管內皮細胞功能損傷是其發(fā)生發(fā)展的關鍵,但發(fā)病分子機制目前尚不完全明確。近期大量研究顯示,微小核糖核酸(micro RNA,mi RNA)在糖脂代謝異常及2型糖尿病(type 2 diabetes,T2DM)、血管內皮細胞損傷中發(fā)揮重要作用。本課題組的前期研究顯示,人外周血循環(huán)中也存在豐富、穩(wěn)定表達mi RNA,是一類新型疾病生物標志物,但糖脂代謝異常及其相關的T2DM微血管并發(fā)癥(type 2 diabetes microvascular complications,T2DMC)人群中循環(huán)mi RNA研究報道較少,循環(huán)mi RNA作為糖脂代謝異常人群新型生物標志物價值、生理功能及參與糖脂代謝異常相關疾病分子機制尚不明確。因此本論文研究目的主要有以下幾個方面:一、篩選高糖高脂患者血清mi RNA表達譜,分析其作為糖脂代謝異�；颊呒膊“l(fā)生發(fā)展?jié)撛诘娘L險預測分子指標潛能。二、檢測T2DM及T2DMC患者血清中胰島和內皮功能損傷相關mi RNA水平及表達特征,探討特定變化mi RNA存在形式及臨床價值,評估其作為T2DM及T2DMC患者新型輔助生物標志物潛能。三、體外構建高糖高脂誘導血管內皮細胞損傷模型,檢測T2DM及T2DMC患者特定變化的mi RNA在細胞中表達變化情況,預測mi RNA內皮細胞功能相關靶基因,初步探討特定mi RNA通過調控其靶基因表達參與高糖高脂誘導內皮細胞損傷分子機制。方法:一、收集高糖、高脂、高糖高脂患者及健康對照血清樣本各30例,通過基于鎖核苷酸(Locked Nucleic Acid,LNA)技術的Exiqon mi RNA芯片技術測定高糖高脂患者血清mi RNA表達譜,初篩芯片中患者與對照顯著變化mi RNA,并選取部分文獻報道m(xù)i RNA,進一步運用實時熒光定量PCR技術(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)在上述樣本中對初篩mi RNA水平進行復篩和驗證,篩選高糖高脂患者顯著變化血清mi RNA,最后通過受試者工作特征曲線(ROC曲線)、邏輯回歸分析方法分析其作為疾病發(fā)生發(fā)展?jié)撛诘娘L險預測分子指標價值。二、收集131例T2DM、131例T2DMC及129例健康對照人群血清標本,運用q RT-PCR檢測T2DM、T2DMC患者及健康對照血清中血管內皮細胞和胰島β細胞高表達、功能相關多種mi RNA水平;生化分析儀測定患者及對照相關生化指標,進一步針對特定變化血清mi RNA,探究其存在形式,最后通過ROC曲線、邏輯回歸分析上述血清mi RNA對T2DM及T2DMC的輔助診斷價值。三、構建高糖和高脂誘導血管內皮細胞損傷模型,光鏡下觀察細胞數(shù)量、形態(tài)變化;q RT-PCR檢測T2DM及T2DMC患者血清變化的mi RNA在細胞中表達水平變化情況,并針對顯著變化特定mi RNA,運用生物信息學方法預測其潛在靶基因,熒光素酶報告實驗驗證mi RNA與靶基因靶向調控關系,Western blot驗證其在細胞模型中靶基因表達水平。結果:一、血清mi RNA芯片結果顯示,高糖高脂人群血清mi RNA表達譜與對照具有明顯差異;6種血清mi RNA(包括mi R-25-5p、mi R-4658、mi R-4773、mi R-4132、mi R-5771-5p和mi R-3165)在高糖高脂人群顯著升高,2種mi RNA(mi R-130b和mi R-494-5p)顯著降低(P0.05);q RT-PCR對芯片mi RNA及文獻報道m(xù)i RNA(mi R-103、mi R-107、mi R-33a、mi R-221、mi R-144和mi R-571)驗證結果顯示,mi R-33a在高糖(8.85±4.2)×10-3、高脂(25.14±4.9)×10-3及高糖高脂(21.18±5.4)×10-3患者血清中水平與對照相比(1.95±0.58)×10-3顯著升高,ROC曲線分析結果顯示mi R-33a作為高糖、高脂及高糖高脂患者診斷指標的曲線下面積分別為0.702(95%CI=0.535~0.87),0.975(95%CI=0.00~1.00)和0.913(95%CI=0.802~1.00);邏輯回歸分析結果顯示,血清mi R-33a是高糖、高脂及高糖高脂患者的危險因素[OR值分別為6.33(95%CI:0.67~60.16),P=0.108;171(14.24~2.05×103),P0.001和76(7.7~750.5),P0.001]。二、運用q RT-PCR技術對T2DM及T2DMC患者血清mi RNA水平測定結果顯示,兩組患者mi RNA水平分別為:T2DM[mi R-16=(23.74±2.70)×10-5,mi R-126=(25.01±4.13)×10-5,mi R-221=(84.76±11.79)×10-5和mi R-7=(173.8±33.77)×10-5]及T2DMC[mi R-16=(43.74±9.61)×10-5,mi R-126=(17.66±2.20)×10-5,mi R-221=(82.52±12.48)×10-5和mi R-7=(176.2±49.27)×10-5],顯著高于健康對照[mi R-16=(14.35±1.00)×10-5,mi R-126=(11.75±1.47)×10-5,mi R-221=(32.26±3.98)×10-5和mi R-7=(67.47±8.44)×10-5](P均0.05),可作為T2DM及T2DMC患者潛在的輔助診斷指標;進一步針對患者特定變化mi R-7存在形式研究顯示,血清mi R-7主要以游離而非外泌體(exosome)包裹形式存在,且血清游離mi R-7對T2DMC患者診斷價值高于血清mi R-7。三、在高糖高脂刺激下,血管內皮細胞數(shù)量明顯減少,形態(tài)也發(fā)生變化;高糖高脂可刺激mi R-661水平顯著上升,生物信息學預測及熒光素酶實驗結果顯示過氧化物酶體增殖物激活受體γ(peroxisome proliferators-activated receptors,PPARs)輔激活因子1α(PGC-1α)是mi R-661潛在的靶基因,Westernblot結果顯示高糖高脂刺激可PGC-1α顯著降低。結論:一、高糖高脂患者血清mi RNA表達譜與對照人群具有明顯不同,患者血清中表達水平顯著升高的mi R-33a可作為糖脂代謝異常患者疾病發(fā)生發(fā)展?jié)撛诘娘L險預測分子指標。二、T2DM及T2DMC患者血清中mi R-7、mi R-16、mi R-126和mi R-221表達水平與健康對照相比顯著升高,是T2DM及T2DMC患者潛在的獨立危險因素和非侵入的輔助診斷標志物,其中患者血清中顯著變化mi R-7主要以游離形式存在,且游離mi R-7對T2DMC患者診斷價值高于血清mi R-7。三、高糖高脂可誘導血管內皮細胞數(shù)量和形態(tài)發(fā)生明顯變化,并通過刺激上調胞內mi R-661水平抑制PGC-1α的表達。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R58

【參考文獻】

相關期刊論文 前3條

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2 蔡加爐;王成;牛冬梅;徐新純;張辰宇;張春妮;汪俊軍;;2型糖尿病及其微血管并發(fā)癥患者血清miR-342-5p和miR-423-5p水平測定及臨床意義[J];臨床檢驗雜志;2015年01期

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本文編號：2318047