發(fā)布時(shí)間：2018-11-01 11:51

【摘要】：背景脂質(zhì)代謝紊亂是中國(guó)人群沉重的健康負(fù)擔(dān)。在中國(guó)人群中開展的流行病研究結(jié)果表明,變化的生活方式、飲食結(jié)構(gòu)與遺傳因素相互作用,共同導(dǎo)致總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)水平增高、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平降低。膽固醇是細(xì)胞膜的重要組成成分之一,在脂質(zhì)雙分子層中起到結(jié)構(gòu)支持及功能調(diào)節(jié)的作用,同時(shí)還是類固醇激素和膽汁酸合成的前體物質(zhì)。人體內(nèi)大多數(shù)類型的細(xì)胞無法分解代謝膽固醇,因此需要通過膽固醇合成、酯化、攝取及外流至循環(huán)中脂蛋白等各個(gè)環(huán)節(jié)保持著細(xì)胞內(nèi)膽固醇的穩(wěn)態(tài)。microRNA (miRNA)是在進(jìn)化上高度保守的小分子非編碼單鏈RNA,長(zhǎng)度約為18-25個(gè)核苷酸。在基因的調(diào)控,尤其是轉(zhuǎn)錄后調(diào)控中起到重要作用。一個(gè)miRNA通常可以調(diào)控很多靶基因,參與到信號(hào)通路轉(zhuǎn)導(dǎo)的多個(gè)環(huán)節(jié)中,因此使得miRNA成為強(qiáng)大的生物調(diào)控因子。很多研究通過基因敲除miRNA小鼠模型或化學(xué)合成miRNA的模擬物或者抑制物來研究miRNA在心血管疾病發(fā)生及發(fā)展過程中所起到的作用。本課題前期研究主要從人類血漿miRNA的差異性表達(dá)入手,通過miRNA芯片技術(shù)篩選出血漿中與HDL代謝相關(guān)的循環(huán)miR-638,并通過生物信息學(xué)靶點(diǎn)預(yù)測(cè)及后續(xù)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)與脂質(zhì)代謝相關(guān)的類固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白相關(guān)脂類轉(zhuǎn)運(yùn)結(jié)構(gòu)域蛋白10(StarD10)為miR-638的靶基因,為進(jìn)一步探討miR-638對(duì)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響提供了研究基礎(chǔ)。目的該部分研究旨在進(jìn)一步探討miR-638對(duì)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的影響。方法為了進(jìn)一步探討miR-638在脂質(zhì)代謝中的作用,本研究分別在HepG2和巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-638模擬物和抑制物。通過對(duì)濃度及時(shí)間的摸索,最終確定使用模擬物和抑制物濃度為20nM,處理時(shí)間48小時(shí)。該濃度及時(shí)間能有效的升高或者降低細(xì)胞內(nèi)miR-638的含量。隨后利用包含84種參與到脂蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)及膽固醇代謝中的關(guān)鍵基因的人類脂蛋白信號(hào)和膽固醇代謝的RT2 ProfilerTM PCR Array芯片檢測(cè)轉(zhuǎn)染了miR-638模擬物和抑制物后細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因表達(dá)的變化水平,并利用Real-time PCR和Western blot技術(shù)在RNA及蛋白質(zhì)水平進(jìn)一步驗(yàn)證芯片結(jié)果。結(jié)果在HepG2細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-638模擬物后能顯著增加細(xì)胞中miR-638的表達(dá)水平,在HepG2細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-638抑制物后能顯著降低細(xì)胞中miR-638的表達(dá)水平。目前已證實(shí)在HepG2細(xì)胞及巨噬細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-638模擬物后能降低三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子A1 ( ABCA1 ),三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運(yùn)子G1 (ABCG1 )和極低密度脂蛋白受體(VLDLR)的RNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平,而轉(zhuǎn)染miR-638抑制物能升高HepG2細(xì)胞中ABCA1和ABCG1的RNA及蛋白質(zhì)表達(dá)水平。結(jié)論miR-638能夠?qū)epG2細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中脂質(zhì)代謝相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)生影響。背景動(dòng)脈粥樣硬化是主要的心腦血管疾病包括冠心病、腦卒中等的共同基礎(chǔ)病變,也是嚴(yán)重危害我國(guó)人民身體健康甚至導(dǎo)致死亡的最主要原因。血漿中過多的膽固醇在動(dòng)脈內(nèi)皮下沉積形成粥樣斑塊,斑塊破裂后形成繼發(fā)血栓堵塞動(dòng)脈管腔,導(dǎo)致心肌缺血或壞死。膽固醇是哺乳類動(dòng)物細(xì)胞膜的主要成分之一,在細(xì)胞增殖、膽汁酸及激素的生物合成當(dāng)中發(fā)揮重要作用。高密度脂蛋白(HDL)能夠?qū)⑼庵芙M織及動(dòng)脈壁中多余的膽固醇轉(zhuǎn)運(yùn)到肝臟,促進(jìn)其經(jīng)膽汁途徑排泄,因而在維持膽固醇代謝動(dòng)態(tài)平衡的過程中發(fā)揮重要作用,這一過程又稱為膽固醇逆轉(zhuǎn)運(yùn)(RCT)。因此,RCT被認(rèn)為是一種重要的動(dòng)脈粥樣硬化保護(hù)過程。很多研究表明,microRNA能夠參與到調(diào)控RCT的過程中。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)血漿內(nèi)miR-638與HDL水平相關(guān)。與血漿高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)正常組相比,低HDL-C組miR-638表達(dá)升高,且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,為進(jìn)一步探討miR-638在RCT中的作用提供了研究依據(jù)。目的該部分研究旨在進(jìn)一步探討miR-638對(duì)細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流的影響。方法用miR-638模擬物/抑制物及miR-638模擬物/抑制物陰性對(duì)照處理HepG2細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,并使細(xì)胞負(fù)載100μg/mL的ox-LDL后孵育NBD-膽固醇。分別使用ApoAI誘導(dǎo)外流液、HDL誘導(dǎo)外流液和標(biāo)準(zhǔn)血清誘導(dǎo)外流液誘導(dǎo)細(xì)胞膽固醇外流。使用熒光酶標(biāo)儀檢測(cè)誘導(dǎo)外流液和細(xì)胞裂解液的熒光強(qiáng)度,并根據(jù)公式計(jì)算NBD-膽固醇外流率。結(jié)果在HepG2細(xì)胞中,miR-638模擬物能抑制ABCA1介導(dǎo)的膽固醇外流至ApoAI和ABCG1介導(dǎo)的膽固醇外流至HDL,而miR-638抑制物能夠促進(jìn)改ABCA1介導(dǎo)的膽固醇外流至ApoAI和ABCG1介導(dǎo)的膽固醇外流至HDL。在巨噬細(xì)胞中miR-638模擬物能夠抑制ABCA1介導(dǎo)的膽固醇外流至ApoAI。結(jié)論miR-638模擬物能夠抑制細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流,而miR-638抑制物能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇外流。
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【學(xué)位授予單位】：中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R589.2

【參考文獻(xiàn)】

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1 李勇;諸駿仁;;臨床血脂研究百年回顧與展望[J];中華心血管病雜志;2015年02期

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本文編號(hào)：2303843