【摘要】：背景脂質代謝紊亂是中國人群沉重的健康負擔。在中國人群中開展的流行病研究結果表明,變化的生活方式、飲食結構與遺傳因素相互作用,共同導致總膽固醇(TC)、低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)、甘油三酯(TG)水平增高、高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)水平降低。膽固醇是細胞膜的重要組成成分之一,在脂質雙分子層中起到結構支持及功能調節(jié)的作用,同時還是類固醇激素和膽汁酸合成的前體物質。人體內大多數(shù)類型的細胞無法分解代謝膽固醇,因此需要通過膽固醇合成、酯化、攝取及外流至循環(huán)中脂蛋白等各個環(huán)節(jié)保持著細胞內膽固醇的穩(wěn)態(tài)。microRNA (miRNA)是在進化上高度保守的小分子非編碼單鏈RNA,長度約為18-25個核苷酸。在基因的調控,尤其是轉錄后調控中起到重要作用。一個miRNA通常可以調控很多靶基因,參與到信號通路轉導的多個環(huán)節(jié)中,因此使得miRNA成為強大的生物調控因子。很多研究通過基因敲除miRNA小鼠模型或化學合成miRNA的模擬物或者抑制物來研究miRNA在心血管疾病發(fā)生及發(fā)展過程中所起到的作用。本課題前期研究主要從人類血漿miRNA的差異性表達入手,通過miRNA芯片技術篩選出血漿中與HDL代謝相關的循環(huán)miR-638,并通過生物信息學靶點預測及后續(xù)細胞實驗證實與脂質代謝相關的類固醇激素合成急性調節(jié)蛋白相關脂類轉運結構域蛋白10(StarD10)為miR-638的靶基因,為進一步探討miR-638對脂質代謝相關基因表達的影響提供了研究基礎。目的該部分研究旨在進一步探討miR-638對脂質代謝相關基因表達的影響。方法為了進一步探討miR-638在脂質代謝中的作用,本研究分別在HepG2和巨噬細胞中轉染miR-638模擬物和抑制物。通過對濃度及時間的摸索,最終確定使用模擬物和抑制物濃度為20nM,處理時間48小時。該濃度及時間能有效的升高或者降低細胞內miR-638的含量。隨后利用包含84種參與到脂蛋白轉運及膽固醇代謝中的關鍵基因的人類脂蛋白信號和膽固醇代謝的RT2 ProfilerTM PCR Array芯片檢測轉染了miR-638模擬物和抑制物后細胞內脂質代謝相關基因表達的變化水平,并利用Real-time PCR和Western blot技術在RNA及蛋白質水平進一步驗證芯片結果。結果在HepG2細胞和巨噬細胞中轉染miR-638模擬物后能顯著增加細胞中miR-638的表達水平,在HepG2細胞中轉染miR-638抑制物后能顯著降低細胞中miR-638的表達水平。目前已證實在HepG2細胞及巨噬細胞中轉染miR-638模擬物后能降低三磷酸腺苷結合盒轉運子A1 ( ABCA1 ),三磷酸腺苷結合盒轉運子G1 (ABCG1 )和極低密度脂蛋白受體(VLDLR)的RNA及蛋白質表達水平,而轉染miR-638抑制物能升高HepG2細胞中ABCA1和ABCG1的RNA及蛋白質表達水平。結論miR-638能夠對HepG2細胞和巨噬細胞中脂質代謝相關基因的表達產生影響。背景動脈粥樣硬化是主要的心腦血管疾病包括冠心病、腦卒中等的共同基礎病變,也是嚴重危害我國人民身體健康甚至導致死亡的最主要原因。血漿中過多的膽固醇在動脈內皮下沉積形成粥樣斑塊,斑塊破裂后形成繼發(fā)血栓堵塞動脈管腔,導致心肌缺血或壞死。膽固醇是哺乳類動物細胞膜的主要成分之一,在細胞增殖、膽汁酸及激素的生物合成當中發(fā)揮重要作用。高密度脂蛋白(HDL)能夠將外周組織及動脈壁中多余的膽固醇轉運到肝臟,促進其經膽汁途徑排泄,因而在維持膽固醇代謝動態(tài)平衡的過程中發(fā)揮重要作用,這一過程又稱為膽固醇逆轉運(RCT)。因此,RCT被認為是一種重要的動脈粥樣硬化保護過程。很多研究表明,microRNA能夠參與到調控RCT的過程中。本課題前期研究發(fā)現(xiàn)血漿內miR-638與HDL水平相關。與血漿高密度脂蛋白膽固醇(HDL-C)正常組相比,低HDL-C組miR-638表達升高,且差異具有統(tǒng)計學意義,為進一步探討miR-638在RCT中的作用提供了研究依據(jù)。目的該部分研究旨在進一步探討miR-638對細胞內膽固醇外流的影響。方法用miR-638模擬物/抑制物及miR-638模擬物/抑制物陰性對照處理HepG2細胞和巨噬細胞,并使細胞負載100μg/mL的ox-LDL后孵育NBD-膽固醇。分別使用ApoAI誘導外流液、HDL誘導外流液和標準血清誘導外流液誘導細胞膽固醇外流。使用熒光酶標儀檢測誘導外流液和細胞裂解液的熒光強度,并根據(jù)公式計算NBD-膽固醇外流率。結果在HepG2細胞中,miR-638模擬物能抑制ABCA1介導的膽固醇外流至ApoAI和ABCG1介導的膽固醇外流至HDL,而miR-638抑制物能夠促進改ABCA1介導的膽固醇外流至ApoAI和ABCG1介導的膽固醇外流至HDL。在巨噬細胞中miR-638模擬物能夠抑制ABCA1介導的膽固醇外流至ApoAI。結論miR-638模擬物能夠抑制細胞內膽固醇外流,而miR-638抑制物能夠促進細胞內膽固醇外流。
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【學位授予單位】：中國人民解放軍醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R589.2

【參考文獻】

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1 李勇;諸駿仁;;臨床血脂研究百年回顧與展望[J];中華心血管病雜志;2015年02期

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本文編號：2303843