【摘要】：研究背景:糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)是糖尿病病人常見的重要并發(fā)癥之一,發(fā)病率在我國呈逐漸上升趨勢,隨著病情的進(jìn)展而成為終末期腎臟病,因此,研究者們盡量想了解糖尿病腎病中腎小球損傷的機(jī)制,希望發(fā)現(xiàn)新的治療策略。足細(xì)胞是高度終末分化的腎小球臟層上皮細(xì)胞,覆蓋于腎小球基底膜(Glomerular basement membrane,GBM)外側(cè),在腎小球功能的調(diào)節(jié)中發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。目前研究一致認(rèn)為足細(xì)胞在DN的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。足細(xì)胞損傷表型改變的主要特征為細(xì)胞凋亡,體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)均證實(shí)高糖(HG)誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡,從而引起其損傷和數(shù)量的減少。但其具體機(jī)制目前仍然不甚清楚,因此,有必要對DN中足細(xì)胞凋亡所致的機(jī)制進(jìn)一步深入研究,為臨床預(yù)防和治療DN提供理論依據(jù)。轉(zhuǎn)錄因子特異性蛋白-1(Sp1)屬于SP/KLF轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一,之前的研究數(shù)據(jù)顯示:Sp1在人類包括甲狀腺、胰腺、肝細(xì)胞、結(jié)直腸和胃癌各種腫瘤中高表達(dá),這可能是腫瘤存在或發(fā)展的關(guān)鍵因素。最近,越來越多的證據(jù)表明Sp1與細(xì)胞凋亡有關(guān),同時一些研究也證實(shí)Sp1還參與DN的發(fā)病機(jī)制。與此同時,有研究表明Sp1在維持足細(xì)胞完整性尤為重要,然而,HG是否激活Sp1在足細(xì)胞中的表達(dá)從而導(dǎo)致足細(xì)胞的凋亡還不清楚,本研究的目的是探討高葡萄糖是否激活體外培養(yǎng)足細(xì)胞Sp1的表達(dá)以及其在高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡中的可能機(jī)制。研究方法永生的小鼠足細(xì)胞在含有正常葡萄糖(NG)、高糖(HG)或Sp1 siRNA培養(yǎng)基中培養(yǎng),用實(shí)時PCR、免疫印跡和免疫熒光測定足細(xì)胞中Sp1的表達(dá)。在使用Sp1 siRNA下調(diào)Sp1表達(dá)的情況下,通過流式細(xì)胞分析儀檢測Sp1在高糖誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡中的作用。使用實(shí)時PCR、免疫印跡方法檢測細(xì)胞凋亡基因Bax的mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0,數(shù)據(jù)用均值士標(biāo)準(zhǔn)差表示。多個組之間的比較使用單向方差分析與Bonferonni's/Turkey檢驗(yàn)或Dunnett's T3檢驗(yàn)。P0.05認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果:在培養(yǎng)的足細(xì)胞中,高糖以時間和劑量依賴的方式刺激Sp1的表達(dá)。用Sp1 siRNA預(yù)處理后(50nm)明顯降低Sp1的表達(dá);同時,高糖引起的細(xì)胞凋亡效應(yīng)也被明顯抑制。此外,我們還發(fā)現(xiàn)HG也增加了足細(xì)胞中Bax的表達(dá),這一效應(yīng)同樣能被Sp1 siRNA所下調(diào)。結(jié)論:Sp1/Bax信號通路在HG誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡中發(fā)揮作用,阻斷Sp1/Bax信號通路可以減少高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:Background: diabetic nephropathy (Diabetic nephropathy,DN) is one of the most common complications in diabetic patients. Researchers try to understand the mechanism of glomerular damage in diabetic nephropathy and hope to find new treatment strategies. Podocytes are highly terminal differentiated epithelial cells in the visceral layer of the glomeruli, covering the outer side of the glomerular basement membrane (Glomerular basement membrane,GBM). Podocytes play an important role in the regulation of glomerular function. Current studies agree that podocytes play an important role in the pathogenesis of DN. Apoptosis is the main characteristic of podocyte damage phenotypic changes. In vitro and in vivo experiments confirmed that high glucose (HG) induced podocyte apoptosis, which resulted in the damage and decrease of the number of podocytes. However, its specific mechanism is still unclear, so it is necessary to further study the mechanism of podocyte apoptosis in DN, to provide a theoretical basis for clinical prevention and treatment of DN. Transcription factor-specific protein-1 (Sp1) is a member of the SP/KLF transcription factor family. Previous studies have shown that Sp1 is highly expressed in human thyroid, pancreas, hepatocytes, colorectal and gastric cancer. This may be a key factor in the existence or development of tumors. Recently, there has been increasing evidence that Sp1 is associated with apoptosis, and some studies have confirmed that Sp1 is also involved in the pathogenesis of DN. At the same time, studies have shown that Sp1 is particularly important in maintaining podocyte integrity. However, it is not clear whether HG activates the expression of Sp1 in podocytes, leading to podocyte apoptosis. The aim of this study was to investigate whether high glucose activates the expression of Sp1 in cultured podocytes and its possible mechanism in inducing apoptosis of podocytes. Methods the immortalized mouse podocytes were cultured in the medium containing normal glucose (NG), high glucose (HG) or Sp1 siRNA. The expression of Sp1 in podocytes was detected by real-time PCR, immunoblotting and immunofluorescence. When Sp1 siRNA was used to down-regulate the expression of Sp1, the role of Sp1 in the apoptosis of podocyte induced by high glucose was detected by flow cytometry. The expression of mRNA and protein of apoptotic gene Bax was detected by real time PCR, Western blotting. The statistical analysis is expressed by the mean standard deviation of SPSS17.0, data. Unidirectional ANOVA and Bonferonni's/Turkey test or Dunnett's test were used to compare the two groups. P05 was considered to have statistical difference. Results: in cultured podocytes, high glucose stimulated the expression of Sp1 in a time and dose dependent manner. After pretreatment with Sp1 siRNA (50nm), the expression of Sp1 was significantly decreased, and the apoptotic effect induced by high glucose was also significantly inhibited. In addition, we found that HG also increased the expression of Bax in podocytes, which was also down-regulated by Sp1 siRNA. Conclusion: Sp1/Bax signaling pathway plays an important role in podocyte apoptosis induced by HG, and blocking Sp1/Bax signaling pathway can reduce the apoptosis induced by high glucose.
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2;R692.9

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本文編號：2291227