【摘要】：背景:Peroxiredoxin Ⅱ(Prx Ⅱ)是一種典型的含有2-Cys殘基的過(guò)氧化物還原酶,在哺乳動(dòng)物的細(xì)胞中廣泛表達(dá)。Prx Ⅱ通過(guò)C端Cys的巰基與另1分子N端Cys的巰基發(fā)生氧化還原反應(yīng),形成二硫鍵,清除H2O2。2010年發(fā)表在《ANTIOXIDANTSREDOX SIGNALING》一篇論文的結(jié)果顯示:real time-PCR檢測(cè)到小鼠腹腔注射STZ后,胰腺組織中Prx Ⅱ的mRNA轉(zhuǎn)錄水平與對(duì)照組相比明顯下降。STZ的分子中有氨基葡萄糖結(jié)構(gòu),能夠特異性通過(guò)GLUT2進(jìn)入胰島β-cell,產(chǎn)生氧化應(yīng)激導(dǎo)致胰島β-cell損傷,誘導(dǎo)血糖升高。雖然Prx Ⅱ的作用研究十分廣泛,但是Prx Ⅱ在STZ誘導(dǎo)的胰島β-cell損傷過(guò)程中的作用尚不清楚,為了深入研究Prx Ⅱ在STZ誘導(dǎo)的胰島β-cell損傷中的保護(hù)作用,本實(shí)驗(yàn)利用Prx Ⅱ基因敲除小鼠(Prx Ⅱ~(-/-))和Prx Ⅱ敲降的Min6小鼠胰島素瘤細(xì)胞研究Prx Ⅱ在STZ誘導(dǎo)的胰島β-cell損傷中的保護(hù)作用。方法:體內(nèi)實(shí)驗(yàn),利用單次200 mg/kg的STZ和連續(xù)5次50 mg/kg/次的STZ(1次/d),腹腔注射6-8周齡的Prx Ⅱ~(+/+)和Prx Ⅱ~(-/-)小鼠誘導(dǎo)胰島β-cell損傷,采用HE染色觀察小鼠胰島組織形態(tài)學(xué)變化,血糖儀檢測(cè)小鼠血糖水平和ELISA檢測(cè)小鼠血清中胰島素水平;腹腔注射2 g/kg的葡萄糖(IPGTT)和1 IU/kg的胰島素(IPITT)分別檢測(cè)小鼠血糖情況。體外實(shí)驗(yàn),利用慢病毒侵染Min6細(xì)胞構(gòu)建穩(wěn)定遺傳的空載體Min6細(xì)胞(Scramble)和Prx Ⅱ敲降的Min6細(xì)胞(shPrx Ⅱ)。首先,采用MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)STZ對(duì)Scramble和shPrx Ⅱ的細(xì)胞毒性作用;然后,采用流式細(xì)胞術(shù)和原位熒光染色檢測(cè)5 mM STZ處理Scramble和shPrx Ⅱ不同時(shí)間下細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡和ROS水平情況;最后,采用Western blotting檢測(cè)細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡以及相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果:體內(nèi)實(shí)驗(yàn),小鼠經(jīng)STZ腹腔注射后,(39)(5)(36)染色觀察到兩種小鼠的胰島β-cell均發(fā)生細(xì)胞死亡,且Prx Ⅱ~(-/-)小鼠胰島β-cell死亡的程度明顯高于Prx Ⅱ~(+/+)小鼠;ELISA結(jié)果顯示,Prx Ⅱ~(-/-)小鼠的胰島素水平顯著低于Prx Ⅱ~(+/+)小鼠;小鼠血糖檢測(cè)發(fā)現(xiàn)兩種小鼠的血糖顯著升高,且在相同時(shí)間下Prx Ⅱ~(-/-)小鼠的血糖顯著高于Prx Ⅱ~(+/+)小鼠,IPGTT也得到相似的結(jié)果。體外實(shí)驗(yàn),成功構(gòu)建能穩(wěn)定遺傳的Prx Ⅱ敲降的Min6小鼠胰島素瘤細(xì)胞(shPrx Ⅱ);MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,隨著STZ處理濃度的增加、時(shí)間的延長(zhǎng),Scramble和shPrx Ⅱ細(xì)胞的存活率都下降,且在相同處理濃度下、時(shí)間下shPrx Ⅱ細(xì)胞的存活率顯著低于Scramble細(xì)胞;流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)隨著5 mM STZ處理時(shí)間的延長(zhǎng),Scramble和shPrx Ⅱ細(xì)胞發(fā)生G2/M期阻滯、細(xì)胞凋亡和ROS水平升高,且在相同處理時(shí)間下shPrxⅡ細(xì)胞的G2/M期阻滯和凋亡顯著高于Scramble細(xì)胞,在9 h,18 h時(shí)shPrx Ⅱ細(xì)胞的ROS水平顯著高于Scramble細(xì)胞;原位熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著5 mM STZ處理時(shí)間的延長(zhǎng),Scramble和shPrx Ⅱ細(xì)胞的凋亡增加,且在相同處理時(shí)間下shPrx Ⅱ細(xì)胞的凋亡顯著高于Scramble細(xì)胞;Western blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞周期相關(guān)蛋白(P21、P16、CyclinB1)和促凋亡相關(guān)蛋白(Bad、Bax、Cleavaged-caspase3)的表達(dá)水平隨著5 mM STZ處理時(shí)間的延長(zhǎng)而增加,且在相同處理時(shí)間下shPrx Ⅱ細(xì)胞中相關(guān)蛋白的表達(dá)水平顯著高于Scramble,而抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表達(dá)水平隨著5 mM STZ處理時(shí)間的延長(zhǎng)而降低,且在相同處理時(shí)間下shPrx Ⅱ細(xì)胞中Bcl-2和Bcl-xl蛋白的表達(dá)水平顯著低于Scramble細(xì)胞。P-AKT、P-GSK-3b、P53和P-P53的表達(dá)水平隨著5 m M STZ處理Scramble和shPrx Ⅱ細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng)而減少,且在相同處理時(shí)間下shPrx Ⅱ相關(guān)蛋白磷酸化水平顯著低于Scramble細(xì)胞。結(jié)論:以上結(jié)果說(shuō)明,在胰島β-cell受到STZ損傷時(shí),Prx Ⅱ的缺失使胰島β-cell大量死亡導(dǎo)致血糖升高,Prx Ⅱ的敲降會(huì)導(dǎo)致P-AKT、P-GSK-3b、P53和P-P53的表達(dá)水平下降,導(dǎo)致胰島β-cell發(fā)生G2/M期阻滯和凋亡。因此,Prx Ⅱ可能通過(guò)調(diào)控P-AKT、P-GSK-3b、P(20)(18)和P-P53的表達(dá)水平保護(hù)胰島β-cell。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類(lèi)號(hào)】：R587.1

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本文編號(hào)：2280325