【摘要】：背景:Peroxiredoxin Ⅱ(Prx Ⅱ)是一種典型的含有2-Cys殘基的過氧化物還原酶,在哺乳動物的細胞中廣泛表達。Prx Ⅱ通過C端Cys的巰基與另1分子N端Cys的巰基發(fā)生氧化還原反應(yīng),形成二硫鍵,清除H2O2。2010年發(fā)表在《ANTIOXIDANTSREDOX SIGNALING》一篇論文的結(jié)果顯示:real time-PCR檢測到小鼠腹腔注射STZ后,胰腺組織中Prx Ⅱ的mRNA轉(zhuǎn)錄水平與對照組相比明顯下降。STZ的分子中有氨基葡萄糖結(jié)構(gòu),能夠特異性通過GLUT2進入胰島β-cell,產(chǎn)生氧化應(yīng)激導(dǎo)致胰島β-cell損傷,誘導(dǎo)血糖升高。雖然Prx Ⅱ的作用研究十分廣泛,但是Prx Ⅱ在STZ誘導(dǎo)的胰島β-cell損傷過程中的作用尚不清楚,為了深入研究Prx Ⅱ在STZ誘導(dǎo)的胰島β-cell損傷中的保護作用,本實驗利用Prx Ⅱ基因敲除小鼠(Prx Ⅱ~(-/-))和Prx Ⅱ敲降的Min6小鼠胰島素瘤細胞研究Prx Ⅱ在STZ誘導(dǎo)的胰島β-cell損傷中的保護作用。方法:體內(nèi)實驗,利用單次200 mg/kg的STZ和連續(xù)5次50 mg/kg/次的STZ(1次/d),腹腔注射6-8周齡的Prx Ⅱ~(+/+)和Prx Ⅱ~(-/-)小鼠誘導(dǎo)胰島β-cell損傷,采用HE染色觀察小鼠胰島組織形態(tài)學(xué)變化,血糖儀檢測小鼠血糖水平和ELISA檢測小鼠血清中胰島素水平;腹腔注射2 g/kg的葡萄糖(IPGTT)和1 IU/kg的胰島素(IPITT)分別檢測小鼠血糖情況。體外實驗,利用慢病毒侵染Min6細胞構(gòu)建穩(wěn)定遺傳的空載體Min6細胞(Scramble)和Prx Ⅱ敲降的Min6細胞(shPrx Ⅱ)。首先,采用MTT實驗檢測STZ對Scramble和shPrx Ⅱ的細胞毒性作用;然后,采用流式細胞術(shù)和原位熒光染色檢測5 mM STZ處理Scramble和shPrx Ⅱ不同時間下細胞周期、細胞凋亡和ROS水平情況;最后,采用Western blotting檢測細胞周期、細胞凋亡以及相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白的表達水平。結(jié)果:體內(nèi)實驗,小鼠經(jīng)STZ腹腔注射后,(39)(5)(36)染色觀察到兩種小鼠的胰島β-cell均發(fā)生細胞死亡,且Prx Ⅱ~(-/-)小鼠胰島β-cell死亡的程度明顯高于Prx Ⅱ~(+/+)小鼠;ELISA結(jié)果顯示,Prx Ⅱ~(-/-)小鼠的胰島素水平顯著低于Prx Ⅱ~(+/+)小鼠;小鼠血糖檢測發(fā)現(xiàn)兩種小鼠的血糖顯著升高,且在相同時間下Prx Ⅱ~(-/-)小鼠的血糖顯著高于Prx Ⅱ~(+/+)小鼠,IPGTT也得到相似的結(jié)果。體外實驗,成功構(gòu)建能穩(wěn)定遺傳的Prx Ⅱ敲降的Min6小鼠胰島素瘤細胞(shPrx Ⅱ);MTT實驗結(jié)果顯示,隨著STZ處理濃度的增加、時間的延長,Scramble和shPrx Ⅱ細胞的存活率都下降,且在相同處理濃度下、時間下shPrx Ⅱ細胞的存活率顯著低于Scramble細胞;流式細胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)隨著5 mM STZ處理時間的延長,Scramble和shPrx Ⅱ細胞發(fā)生G2/M期阻滯、細胞凋亡和ROS水平升高,且在相同處理時間下shPrxⅡ細胞的G2/M期阻滯和凋亡顯著高于Scramble細胞,在9 h,18 h時shPrx Ⅱ細胞的ROS水平顯著高于Scramble細胞;原位熒光染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著5 mM STZ處理時間的延長,Scramble和shPrx Ⅱ細胞的凋亡增加,且在相同處理時間下shPrx Ⅱ細胞的凋亡顯著高于Scramble細胞;Western blotting結(jié)果發(fā)現(xiàn)細胞周期相關(guān)蛋白(P21、P16、CyclinB1)和促凋亡相關(guān)蛋白(Bad、Bax、Cleavaged-caspase3)的表達水平隨著5 mM STZ處理時間的延長而增加,且在相同處理時間下shPrx Ⅱ細胞中相關(guān)蛋白的表達水平顯著高于Scramble,而抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xl的表達水平隨著5 mM STZ處理時間的延長而降低,且在相同處理時間下shPrx Ⅱ細胞中Bcl-2和Bcl-xl蛋白的表達水平顯著低于Scramble細胞。P-AKT、P-GSK-3b、P53和P-P53的表達水平隨著5 m M STZ處理Scramble和shPrx Ⅱ細胞時間的延長而減少,且在相同處理時間下shPrx Ⅱ相關(guān)蛋白磷酸化水平顯著低于Scramble細胞。結(jié)論:以上結(jié)果說明,在胰島β-cell受到STZ損傷時,Prx Ⅱ的缺失使胰島β-cell大量死亡導(dǎo)致血糖升高,Prx Ⅱ的敲降會導(dǎo)致P-AKT、P-GSK-3b、P53和P-P53的表達水平下降,導(dǎo)致胰島β-cell發(fā)生G2/M期阻滯和凋亡。因此,Prx Ⅱ可能通過調(diào)控P-AKT、P-GSK-3b、P(20)(18)和P-P53的表達水平保護胰島β-cell。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.1

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本文編號：2280325