【摘要】：肥胖以及由于肥胖引起的一系列相關(guān)性疾病,如II型糖尿病、心腦血管疾病、癌癥等已經(jīng)成為世界性關(guān)注的問題[1]。肥胖過程中脂質(zhì)代謝紊亂是其最根本的原因之一,而代謝綜合征的最基本環(huán)節(jié)是脂質(zhì)代謝紊亂[2]。脂質(zhì)代謝紊亂是由于內(nèi)外環(huán)境因素所致的脂質(zhì)代謝產(chǎn)物表達(dá)量或者分布異常的現(xiàn)象[3]。大量研究證實(shí),在脂質(zhì)代謝的過程中,血液中游離脂肪酸含量增加,脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)酶(FAT/CD36)作為脂肪酸重要代謝酶之一,在多種組織細(xì)胞均有廣泛分布,在很多的肥胖和炎癥模型中都可檢測到FAT/CD36表達(dá)量的改變,然而對于FAT/CD36表達(dá)量改變的機(jī)制以及其在孕期炎癥所致肥胖中的具體機(jī)制尚不明確[4]。在炎癥反應(yīng)中,炎癥免疫因子PTX3是人體固有體液免疫中的一個(gè)重要組成成分,主要通過與C1q和H因子相互作用,激活和調(diào)節(jié)補(bǔ)體級聯(lián)反應(yīng),發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用,在抵抗特異性微生物以及調(diào)控炎癥方面發(fā)揮重要作用[5]。近幾年,PTX3與肥胖和炎癥之間的關(guān)系研究越來越深入,肥胖是一種慢性低豐度炎癥已經(jīng)成為一個(gè)公認(rèn)的事實(shí)[6]。然而炎癥是否會(huì)直接引起肥胖卻鮮少報(bào)道,大量實(shí)驗(yàn)證明,很多慢性病的起因要追溯到生命的早期,宮內(nèi)炎癥引起子代代謝性疾病與肥胖作為一種獨(dú)立因素,在肥胖的發(fā)病機(jī)制中至關(guān)重要[7];在以往的大多數(shù)炎癥與肥胖模型中,都是通過小鼠后天的炎癥刺激或飲食誘導(dǎo),因后天人為因素干預(yù),故較難反應(yīng)動(dòng)物自然生長狀態(tài)下炎癥的真實(shí)情況,而我們的模型選擇對母代孕鼠進(jìn)行炎癥刺激,研究子代小鼠的發(fā)育與代謝狀況,去探討肥胖的發(fā)生與炎癥的關(guān)系,因未對子代小鼠做任何人為干預(yù),故更能自然、貼切的反應(yīng)機(jī)體慢性炎癥狀態(tài)下,小鼠發(fā)生代謝性疾病的真實(shí)狀況,通過我們科室前期的研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn),孕期一次性LPS刺激會(huì)導(dǎo)致子代小鼠出現(xiàn)肥胖[7,8],然而其具體的機(jī)制尚不清楚,所以本論文從脂肪代謝調(diào)節(jié)因子FAT/CD36與炎癥免疫因子PTX3的角度出發(fā),去探討炎癥和肥胖之間的通路調(diào)節(jié)機(jī)制,以期為炎癥與肥胖之間的關(guān)系做進(jìn)一步的研究。方法:1.孕期炎癥刺激對子代小鼠脂肪發(fā)育、脂質(zhì)代謝及FAT/CD36表達(dá)量的影響1.1從第三軍醫(yī)大學(xué)動(dòng)物房購買C57小鼠于SPF級環(huán)境下正常飼養(yǎng)至8周齡,雌鼠體重(20±2)g,雄鼠體重(25±2)g,于第一天下午18:00按照雌:雄=2:1的比例同籠配種,第二天早上7:00分籠飼養(yǎng),并記錄各籠小鼠體重,記為在孕0天,于第十一天時(shí)稱量孕鼠體重,若與在孕0天相比,體重增加大于2g且觀察小鼠腹部出現(xiàn)明顯隆起,則確定懷孕。1.2將確定懷孕的孕鼠隨機(jī)分為2組,對照組NS:在孕第11天腹腔一次性注射無菌生理鹽水0.2ml;LPS組:在孕第11天一次性腹腔注射LPS 75μg.kg-1,懷孕以后取子代小鼠作為研究對象,構(gòu)建孕期炎癥子代小鼠模型。1.3兩組子代小鼠從出生開始(設(shè)為第0天)進(jìn)行體重監(jiān)測,每2w測量一次體重(g)直到12w并于4w、8w和12w分別取樣,稱取脂肪濕重(g),并計(jì)算脂肪系數(shù)(脂肪系數(shù)=脂肪濕重/體重×100),測量母體孕期炎癥刺激對子代小鼠脂肪發(fā)育的影響。1.4通過眼球取血,分別在4w、8w和12w時(shí)獲取子代雄鼠的血液樣本,通過試劑盒分別檢測雄鼠血液中游離脂肪酸(FFA)、甘油三脂(TG)含量。1.5子代雄鼠于4w、8w和12w取雄鼠附睪脂肪組織,通過試劑盒分別檢測雄鼠脂肪組織中游離脂肪酸(FFA)、甘油三脂(TG)含量。1.6 Real-time PCR法和Western Blot方法分別檢測子代雄鼠附睪脂肪中FAT/CD36 m RNA表達(dá)水平和蛋白的表達(dá)水平。1.7 Real-time PCR檢測誘導(dǎo)分化3T3-L1細(xì)胞中m RNA表達(dá)水平和Western Blot法檢測誘導(dǎo)分化3T3-L1細(xì)胞中FAT/CD36含量的蛋白表達(dá)水平。2.孕期炎癥刺激對子代小鼠肥胖的機(jī)制研究2.1子代雄鼠于4W、8W和12W取附睪脂肪組織,通過通過Real-time PCR法和Western Blot方法檢測PTX3 m RNA和蛋白水平表達(dá)量。2.2 Real-time PCR法和Western Blot方法分別檢測子代雄鼠附睪脂肪組織中脂肪分化標(biāo)志物(a P2、PPARγ、CEBP/α、CEBP/β)m RNA水平和蛋白水平表達(dá)量。2.3轉(zhuǎn)染si RNA和過表達(dá)PTX3質(zhì)粒對3T3-L1細(xì)胞中PTX3、脂肪分化標(biāo)志物(a P2、PPARγ、CEBP/α、CEBP/β)m RNA水平和脂肪分化標(biāo)志物蛋白水平表達(dá)量影響。2.4流式細(xì)胞技術(shù)檢測轉(zhuǎn)染si RNA和過表達(dá)PTX3質(zhì)粒對3T3-L1細(xì)胞凋亡的影響。2.5 MTT法檢測轉(zhuǎn)染si RNA和過表達(dá)PTX3質(zhì)粒對3T3-L1細(xì)胞的增殖的影響。2.6油紅染色檢測轉(zhuǎn)染si RNA和過表達(dá)PTX3質(zhì)粒對3T3-L1細(xì)胞分化的影響。2.7 Western Blot方法檢測子代雄鼠附睪脂肪組織中MAPK通路相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量。結(jié)果:1.孕期炎癥刺激對子代小鼠脂肪發(fā)育的影響1.1與NS組相比,LPS組各周齡雄鼠體重、附睪脂肪濕重及4W、8W附睪脂肪系數(shù)均增加,差異具有顯著性(p0.05)(Fig.1-3);8W、12W子代雌鼠體重、4W、8W、12W子代雌鼠腎周脂肪濕重及8W、12W腎周脂肪系數(shù)均增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)(Fig.1-3)。1.2與NS組相比,LPS組4w、8w、12w子代雄鼠血液中的FFA表達(dá)量顯著增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)(p0.05)(Fig.4A);LPS組子代雄鼠血液中8w、12w TG含量顯著增高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)(Fig.4B)。1.3與NS組相比,LPS組4w、8w、12w子代雄鼠脂肪組織中的FFA含量顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)(Fig.5A);LPS組子代雄鼠脂肪組織中8w、12w TG含量顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)(Fig.5B)。1.4與NS組相比,LPS組子代雄鼠附睪脂肪組織中FAT/CD36 m RNA水平表達(dá)量顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)(Fig.6);LPS組雄鼠附睪脂肪組織中4w、8w FAT/CD36蛋白水平表達(dá)量顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)(Fig.7)。1.5與正常組相比;誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞中FAT/CD36 m RNA水平表達(dá)量顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)(Fig.8);誘導(dǎo)的3T3-L1細(xì)胞中FAT/CD36蛋白水平表達(dá)量顯著增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.01)(Fig.9)。2.孕期炎癥刺激對子代小鼠肥胖的機(jī)制研究2.1與NS組相比,LPS組PTX3 m RNA水平和蛋白水平表達(dá)量均顯著升高(p0.05)(Fig.10)。2.2與NS組相比,4W CEBP/α、CEBP/β、PPARγ和8W CEBP/α、PPARγ以及12W CEBP/β、a P2、PPARγ子代小鼠脂肪分化標(biāo)志物m RNA水平和蛋白水平表達(dá)量均顯著升高(p0.05)(Fig.11)。2.3在轉(zhuǎn)染si RNA的3T3-L1細(xì)胞中,與NS組相比,炎癥因子PTX3、脂肪分化標(biāo)志物(CEBP/α、a P2)的表達(dá)量顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)(Fig.12);在過表達(dá)PTX3質(zhì)粒的細(xì)胞中,與Control組相比,過表達(dá)PTX3質(zhì)粒的3T3-L1前脂肪細(xì)胞脂肪分化標(biāo)志物(a P2、PPARγ、CEBP/α、CEBP/β)表達(dá)量顯著升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)(Fig.12)。2.4與NS組組相比,過表達(dá)組對3T3-L1細(xì)胞凋亡沒有顯著影響,抑制表達(dá)PTX3顯著降低3T3-L1細(xì)胞的凋亡(p0.05)(Fig.13A)。2.5與NS組相比,過表達(dá)組與抑制表達(dá)組對3T3-L1細(xì)胞周期沒有顯著影響(p0.05)(Fig.13B)。2.6油紅染色的結(jié)果顯示,過表達(dá)PTX3組中,細(xì)胞的分化為成熟細(xì)胞的程度和數(shù)量顯著增加,抑制表達(dá)組細(xì)胞的分化程度和數(shù)量顯著減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)(Fig.13C)。2.7與對照組相比,過表達(dá)組與抑制表達(dá)組對3T3-L1細(xì)胞的增殖沒有顯著影響(p0.05)(Fig.13D)。2.8與NS組相比,LPS組子代雄鼠脂肪組織中的非磷酸化MAPK(P38、JNK、ERK1/2)相關(guān)蛋白4W ERK1/2(P42/P44)、JNK/SNPK(P46/P54)、8W ERK1/2(P42/P44)以及12W JNK/SNPK(P46/P54)含量顯著降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)(Fig.14A-C);磷酸化MAPK(p-P38、p-JNK/SNPK、p-ERK1/2)相關(guān)蛋白p-P38、p-JNK/SNPK(p-P42/P44)、p-ERK1/2(p-P46/P54)含量顯著升高(p0.05)(Fig.14D-F)。結(jié)論1.在給予母代孕鼠一次性孕期LPS炎癥刺激以后,子代小鼠出現(xiàn)了以體重增加、脂肪濕重增加、脂肪系數(shù)變大且血液中和脂肪組織中FFA和TG含量異常增多的脂質(zhì)代謝紊亂現(xiàn)象,并且在誘導(dǎo)分化的3T3-L1細(xì)胞中,FAT/CD36的表達(dá)量較正常組也顯著升高,提示在孕期炎癥導(dǎo)致子代小鼠脂質(zhì)代謝紊亂過程中,FAT/CD36具有重要的作用。2.通過給予母代小鼠一次性LPS刺激,建立的炎癥與肥胖模型研究展示孕期炎癥刺激導(dǎo)致子代小鼠中PTX3含量顯著增加,高表達(dá)的PTX3通過正向調(diào)節(jié)脂肪分化標(biāo)志物的表達(dá)量促進(jìn)脂肪細(xì)胞的形成增加,最終導(dǎo)致肥胖的發(fā)生。3.MAPK通路的過度活化可能在PTX3上調(diào)節(jié)脂肪分化標(biāo)志物,增加肥胖易感性中具有重要作用。
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【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R589.2

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前2條

1 高萌;孕期炎癥刺激對子代小鼠體重的影響及機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

2 萬克強(qiáng);炎癥對不同組織細(xì)胞脂質(zhì)代謝和FAT/CD36表達(dá)影響的研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2012年

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本文編號：2278663