【摘要】：【背景】肥胖癥,因脂肪細胞增殖異常,脂肪組織過度堆積造成機體生理、病理改變同時伴有體重異常增加。由于生活方式以及膳食結(jié)構(gòu)的改變,目前世界范圍內(nèi)肥胖人口的比率呈顯著增加趨勢。肥胖會增加罹患糖尿病,冠心病,腦血管疾病,高血壓以及高血脂癥的發(fā)病風(fēng)險,嚴(yán)重影響人類健康以及生活質(zhì)量。因此,對于肥胖疾病的深入研究,將有助于其治療及預(yù)防。脂肪組織是機體中最大的內(nèi)分泌器官,同時還具有儲存脂質(zhì),調(diào)節(jié)機體能量代謝平衡的作用。脂肪組織的功能紊亂,會顯著影響機體的代謝水平,從而引起一系列代謝紊亂性疾病的發(fā)生。Hippo-YAP信號通路首先在果蠅中發(fā)現(xiàn),在哺乳動物體內(nèi)具有高度保守性,參與調(diào)控組織及器官大小。多項研究提示Hippo-YAP信號通路的調(diào)控與能量代謝密切相關(guān),并且在3T3-L1細胞中的研究發(fā)現(xiàn)YAP的激活可抑制脂肪分化,但對于其在脂肪組織中的功能以及對肥胖相關(guān)代謝性疾病的影響缺乏系統(tǒng)的研究,相關(guān)機制較為匱乏。【目的】研究YAP在脂肪分化以及脂肪分解中的作用及其機制,探究YAP對肥胖相關(guān)代謝性疾病的影響。【方法】構(gòu)建脂肪組織特異性過表達YAP的轉(zhuǎn)基因小鼠。高脂飲食喂養(yǎng)12周誘導(dǎo)小鼠肥胖模型,檢測脂肪組織中YAP變化情況。使用膠原酶消化法,分離小鼠的成熟脂肪細胞,同時結(jié)合免疫組織化學(xué)方法檢測YAP的表達情況。檢測無酚紅培養(yǎng)基以及小鼠血清中的甘油三酯的含量,評價小鼠脂肪分解的在體水平。實時定量PCR以及蛋白免疫印跡方法,分析與脂肪分解相關(guān)分子的表達變化。使用胰酶消化法分離得到轉(zhuǎn)基因小鼠前脂肪細胞以及成熟的脂肪細胞。前脂肪細胞在細胞長到相互匯合時,給予分化液(IBMX 0.0115g/mL,胰島素1mg/mL,地塞米松1mM)處理,收集促分化液處理不同時間點的脂肪細胞,檢測分化后YAP的mRNA水平、磷酸化(P-YAP)以及總YAP(T-YAP)的蛋白水平。RT-PCR以及Western Blot檢測Hippo-YAP的表達情況。誘導(dǎo)野生型小鼠與脂肪組織YAP過表達小鼠(YAPtg~fAP2~(Cre+),YAPtgfAdCre+),兩種基因型小鼠前脂肪細胞分化,Oil Red O方法比較兩者分化能力。Western Blot檢測與分化相關(guān)的關(guān)鍵因子蛋白水平變化。高脂飲食喂養(yǎng)轉(zhuǎn)基因小鼠12周,油紅O染色以及肝臟的脂質(zhì)抽提檢測YAP的表達水平改變后,脂肪功能的改變是否會影響肝臟的脂質(zhì)沉積。葡萄糖耐量試驗(IPGTT)評價小鼠胰島素抵抗是否有改變。所有實驗結(jié)果均利用統(tǒng)計學(xué)方法進行方差分析或T檢驗,以P0.05作為存在顯著性差異的標(biāo)準(zhǔn)。【結(jié)果】在肥胖早期白色脂肪組織中T-YAP蛋白的降解增加,YAP的mRNA水平加增,P-YAP/T-YAP的比例顯著增加;隨著肥胖的進展,兩組小鼠中P-YAP/T-YAP以及YAP的mRNA同樣顯著增加,但T-YAP蛋白水平表達差異縮小,提示增加的YAP mRNA不斷的對YAP總蛋白進行補充。肥胖過程中YAP的表達改變提示其參與了肥胖的發(fā)生發(fā)展。為進一步研究YAP對脂肪功能的影響。我們分離野生型小鼠的原代前脂肪細胞并進行培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)隨著前脂肪細胞分化的發(fā)生發(fā)展,T-YAP的表達水平明顯降低。與此同時,參與前脂肪分化的相關(guān)基因C/EBPα,C/EBPβ,PPARγ的表達亦顯著增加,表明YAP參與前脂肪細胞的分化過程。而YAPtg~fAP2~(Cre+)小鼠的原代前脂肪細胞分化被抑制,同時發(fā)現(xiàn)脂肪分化關(guān)鍵核受體在脂肪細胞分化8天后C/EBPα,PPARγ表達水平較對照小鼠顯著降低,C/EBPβ有下降的趨勢。單位細胞量中甘油的釋放量實驗顯示,過表達YAP小鼠成熟脂肪細胞的甘油釋放量顯著增加。饑餓狀態(tài)下的甘油釋放結(jié)果顯示,YAPtg~fAP2~(Cre+)較對照小鼠,血漿中甘油水平明顯增加。以上結(jié)果表明,脂肪組織中過表達YAP抑制前脂肪細胞向成熟脂肪細胞分化,同時促進成熟脂肪細胞的分解能力。高脂飲食引起YAPtg~fAP2~(Cre+)小鼠脂肪重量和脂肪體重降低,且血清甘油三酯(TG)及膽固醇(CHO)水平明顯高于正常小鼠。在YAPtg~fAP2~(Cre+)過表達小鼠中,成熟脂肪細胞的個體形態(tài)較正常對照小鼠明顯偏小,視野內(nèi)數(shù)量較少。兩種YAP過表達小鼠模型均表現(xiàn)出,肝臟脂質(zhì)沉積狀況較正常小鼠嚴(yán)重。肝臟的脂質(zhì)抽提,結(jié)果顯示TG以及CHO的含量較正常對照小鼠明顯增加,在YAPtgfAdCre+小鼠過表達體系中,小鼠表現(xiàn)出顯著的胰島素抵抗�！窘Y(jié)論】肥胖的發(fā)病過程中脂肪組織P-YAP/YAP以及YAP的mRNA水平顯著增加;YAP表達增加可抑制肥胖狀態(tài)下脂肪組織中前脂肪細胞向成熟脂肪分化、促進成熟脂肪的分解、脂質(zhì)釋放入血,最終加劇肝臟脂質(zhì)沉積、血脂紊亂以及胰島素抵抗等肥胖相關(guān)代謝疾病的發(fā)生。
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【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R589.2

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 韓昌洪;;脂肪組織功能的研究進展[J];實用醫(yī)學(xué)雜志;2007年06期

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本文編號：2275337