【摘要】：目的:2型糖尿病(type 2 diabetes mellitus,T2DM)是由遺傳和環(huán)境因素共同作用所致的代謝性疾病,發(fā)病機(jī)制復(fù)雜。流行病學(xué)調(diào)查顯示,遺傳基因在糖尿病及其慢性并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展中起到了重要作用,對糖尿病易感基因的研究是近年來糖尿病遺傳機(jī)制研究的重點和熱點。T2DM慢性并發(fā)癥中大血管病變病情重、死亡率高,其病理改變的基礎(chǔ)是動脈粥樣硬化(arteriosclerosis,AS)。目前研究表明,煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADPH)氧化酶來源的活性氧(reactive oxygen species,ROS)與糖尿病和AS的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),而p47phox是NADPH氧化酶系統(tǒng)的主要成份,在中性粒細(xì)胞和血管系統(tǒng)ROS的產(chǎn)生過程中發(fā)揮了重要作用。單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism,SNP)作為研究疾病基因多態(tài)性的新工具,廣泛應(yīng)用于定位多基因疾病的主要致病基因及進(jìn)行發(fā)病機(jī)理的研究。目前對p47phox基因SNP與T2DM關(guān)系的研究較少。ROS在體內(nèi)過度蓄積,氧化應(yīng)激水平超出體內(nèi)抗氧化能力時會造成DNA的氧化損傷。8-羥基脫氧鳥苷(8-hydroxy-2-deoxyguanosine,8-OHd G)可以反映整個機(jī)體平均的氧化損傷率及體內(nèi)DNA氧化損傷與機(jī)體的正常修復(fù)作用,其在人體的含量穩(wěn)定且靈敏度高,是評價氧化應(yīng)激強(qiáng)度的最佳指標(biāo)。本研究旨在通過研究p47phox基因SNP與T2DM及其大血管病變的關(guān)系,從分子水平探討其發(fā)病機(jī)制,為預(yù)防和治療提供理論依據(jù);同時觀察T2DM患者血清8-OHd G水平,明確在T2DM及其大血管病變發(fā)生中NADPH氧化酶起到的作用。方法:按1999年WHO提出的T2DM診斷標(biāo)準(zhǔn),選擇沒有血緣關(guān)系的T2DM患者共300例,按是否合并大血管病變分成單純T2DM組156例,男90例,女66例,最大年齡77歲,最小年齡31歲,平均年齡51.6±10.0歲,平均病程4.2±1.3年;T2DM大血管病變組144例,男84例,女60例,最大年齡76歲,最小年齡28歲,平均年齡55.0±11.3歲,平均病程10.6±2.3年。正常對照組:為同期我院醫(yī)務(wù)人員及常規(guī)體檢人群中健康個體140例,男85例,女55例,最大年齡76歲,最小年齡36歲,平均年齡53.0±9.1歲,無心、腦、肝、腎臟病史。受試者禁食12小時,空腹抽取兩管4ml靜脈血,一管用乙二胺乙酸抗凝,用于提取基因組DNA,另一管分離血清,用于生化指標(biāo)和8-OHd G的檢測,靜脈血和血清均于-20℃冰箱保存。1臨床指標(biāo)的測定1.1測定身高、體重、腰圍、臀圍、收縮壓(systolic blood pressure,SBP)、舒張壓(diastolic blood pressure,DBP)和踝動脈壓,計算體重指數(shù)(body mass index,BMI)=體重/身高2、腰/臀(waist-to-hip ratio,WHR)=腰圍/臀圍和踝肱指數(shù)(Ankle brachial pressure index,ABI)=踝動脈收縮壓/肱動脈收縮壓。1.2應(yīng)用全自動生化分析儀測定空腹血糖(fasting blood-glucose,FBG)、甘油三酯(triglycerides,TG)、總膽固醇(total cholesterol,TC)、低密度脂蛋白膽固醇(low density lipoprotein cholesterol,LDL-C)及高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol,HDL-C)。1.3用免疫比濁法測定糖化血紅蛋白(hemoglobin A1c,Hb A1c)。2酶聯(lián)免疫吸附法測定8-OHd G的水平。3 NADPH氧化酶p47phox基因G338A多態(tài)性的檢測3.1人基因組DNA樣品的制備:用血液基因組DNA小量提取試劑盒(由上海捷瑞生物工程有限公司提供)提取乙二胺乙酸抗凝血外周血基因組DNA,然后分光光度儀測定DNA溶液濃度和純度。3.2聚合酶鏈反應(yīng)(PCR):擴(kuò)增模板為外周血白細(xì)胞基因組DNA,上、下游引物序列分別是:5’-TCCCAAGTGGTTTGACGG-3’、5’-CCTCCTCTTTCTGGCTGTG-3’,25μl反應(yīng)體系含基因組DNA2μl,上下游引物各1μl,PCR Premix 12.5μl,滅菌蒸餾水8.5μl。反應(yīng)條件:94℃預(yù)變性3分鐘,94℃變性30秒,54℃退火30秒,72℃延伸40秒,共35個循環(huán),循環(huán)結(jié)束后72℃延伸3分鐘,反應(yīng)管4℃冷卻10分鐘。然后將PCR產(chǎn)物純化,將純化后的PCR產(chǎn)物在測序儀上測序。4統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS19.0軟件處理所有數(shù)據(jù),以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。對計量資料進(jìn)行正態(tài)性檢驗,結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±Χs)表示;各組基因頻率的群體代表性用Hardy-Weinberg平衡法檢驗;計量資料的組間比較用方差分析;計數(shù)資料的組間比較用X2檢驗;8-OHd G濃度與其他因素的相關(guān)性分析采用Spearman或Pearson相關(guān)分析;用logistic逐步回歸分析T2DM大血管病變發(fā)生的危險因素,以P0.05定義為選入標(biāo)準(zhǔn),P0.10為剔除標(biāo)準(zhǔn)。結(jié)果:1 T2DM組與正常對照組的年齡、性別、BMI的構(gòu)成比無顯著性差別,具有可比性;單純T2DM和T2DM大血管病變組的吸煙史、WHR、SBP、DBP、TC、TG、LDL-C及FBG水平顯著高于正常對照組(t分別為-1.563、-1.793、-2.474、-2.296、-1.952、-1.504、-2.261、-7.191和-1.784、-2.410、-2.774、-2.576、-1.569、-1.752、-2.710、-8.675,均P0.05),HDL-C水平低于正常對照組(t分別為2.183和4.224,均P0.05);T2DM大血管病變組的糖尿病病程、吸煙史、WHR、SBP、DBP、TG、LDL-C、FBG及Hb A1c水平顯著高于單純T2DM(t分別為-2.681、-2.716、-3.328、-3.002、-2.863、-3.619、-2.299、-1.979和-2.037,均P0.05),ABI、HDL-C水平低于單純T2DM組(t分別為1.913和1.863,均P0.05)。單純T2DM組8-OHd G水平(6.41±2.04ng/ml)較正常對照組(4.16±2.11ng/ml)明顯升高(t=-4.662,P0.05),大血管病變組(7.88±2.80ng/ml)明顯高于單純T2DM組和正常對照組(t分別為-3.215和-6.354,均P0.05)。2 8-OHd G與糖尿病病程、吸煙史、TC、FBG及Hb A1c呈顯著正相關(guān)(r分別為0.324、0.337、0.172、0.213和0.328,均P0.05),與ABI和HDL-C呈顯著負(fù)相關(guān)(r分別為-0.383和-0.173,均P0.05),與年齡、BMI、WHR、TG和LDL-C無顯著相關(guān)性。3正常對照組、單純T2DM組、T2DM大血管病變組GA+AA基因型頻率分別為7.14%、21.15%和29.17%,A等位基因頻率分別為3.57%、11.54%和15.97%。比較各組GA+AA基因型頻率和等位基因A頻率,單純T2DM組和T2DM大血管病變組均高于正常對照組(X2分別為11.665、23.020和13.070、24.566,均P0.05),單純T2DM組和T2DM大血管病變組間無顯著性差異(X2分別為2.564和2.495,P分別為0.109和0.114)。4與GG型相比,GA+AA型的高血壓病史、BMI、SBP、DBP、FBG、Hb A1c及8-OHd G升高(t分別為-2.163、-2.090、-2.624、-3.011、-2.870、-1.989和-2.037,均P0.05),ABI降低(t=2.184,P0.05)。兩組間年齡、性別、病程、冠心病病史、腦卒中病史、WHR、TC、TG、LDL-C和HDL-C無顯著差別(P0.05)。GA+AA型大血管病變發(fā)生率為49.4%,高于GG型大血管病變發(fā)生率的28.7%(X2=13.32,P0.05)。5在T2DM患者中,有無大血管病變作為因變量進(jìn)行逐步回歸分析,結(jié)果顯示糖尿病病程、SBP、ABI、LDL-C及8-OHd G是大血管病變的獨立危險因素(β分別為0.227、0.484、-1.162、1.756和0.224,均P0.05)。將T2DM大血管病變組患者根據(jù)是否合并高血壓進(jìn)行分組后再比較,發(fā)現(xiàn)T2DM大血管病變合并高血壓患者中,糖尿病病程、ABI、LDL-C、8-OHd G和等位基因A是其獨立危險因素(β分別為0.534、-0.765、1.467、0.526和0.509,均P0.05)。結(jié)論:1 T2DM患者血清8-OHd G水平升高,提示其體內(nèi)存在氧化應(yīng)激,并且T2DM大血管病變者較單純T2DM患者更顯著。2 T2DM患者血清8-OHd G水平與NADPH氧化酶G338A基因多態(tài)性相關(guān),A等位基因攜帶者血清8-OHd G水平較高,后者是T2DM大血管病變的危險因素。3 p47phox亞基G338A基因多態(tài)性可能與T2DM大血管病變的易感性無關(guān),338A等位基因不是T2DM大血管病變的易感基因,但是T2DM大血管病變合并高血壓的獨立危險因素。
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【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2265518