【摘要】：目的類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(RA)是一種慢性炎癥性疾病,其發(fā)病特點(diǎn)主要為對稱性的多關(guān)節(jié)滑膜炎和大量新生血管的形成。已有研究結(jié)果顯示血清淀粉樣蛋白A(SAA)在其發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。本研究首先分析了TLR4在RA患者滑膜組織中的表達(dá),并進(jìn)一步檢測了SAA與TLR4的相互作用對HUVECs產(chǎn)生促血管生成因子VEGF,Ang-1,Ang-2的影響。最后,通過體外構(gòu)建三維血管模型,深入探討SAA與TLR4結(jié)合介導(dǎo)的NFκB信號途徑在RA新生血管形成機(jī)制中的作用。本研究旨在探究SAA促進(jìn)RA血管新生的分子機(jī)制,為RA的臨床診斷和治療尋找新的可靠的靶點(diǎn)奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法1.免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測RA和OA患者滑膜組織中TLR4的表達(dá)。2.采用HUVECs體外細(xì)胞培養(yǎng)模型,細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)和MTT實(shí)驗(yàn)分析SAA與TLR4的相互作用對內(nèi)皮細(xì)胞遷移、增殖的影響。3.通過體外構(gòu)建三維血管模型,分析SAA與TLR4的相互作用對內(nèi)皮細(xì)胞形成新生血管的影響。4.ELISA方法分析SAA與TLR4的相互作用對內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生促血管生成因子的影響。5.采用western blot方法分析在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)中SAA-TLR4相互作用對NFκB信號途徑活化的影響。結(jié)果1.免疫組化結(jié)果顯示,TLR4廣泛表達(dá)于RA滑膜組織的襯里層及襯里下層,主要表達(dá)在血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、巨噬細(xì)胞及血管周圍;而在OA則少量表達(dá)于滑膜襯里層及成纖維細(xì)胞,且二者相比表達(dá)的量和位置均有顯著差異。2.細(xì)胞遷移、MTT實(shí)驗(yàn)以及體外三維血管模型結(jié)果分別顯示,SAA可顯著促進(jìn)HUVECs的增殖和遷移,以及相互連接構(gòu)成新生血管;在TLR4被抑制后,SAA介導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的遷移、增殖程度以及血管新生明顯受到抑制。3.ELISA結(jié)果顯示SAA作用下HUVECs可產(chǎn)生VEGF、Ang-1、Ang-2等促進(jìn)新生血管形成的因子,而TLR4被抑制后,VEGF的生成明顯減少,其他幾種因子所受影響不明顯。4.Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示HUVECs受SAA刺激后,NFκB分子明顯活化,而一旦TLR4被抑制,NFκB的活化受到明顯抑制。5.細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)以及體外三維血管模型結(jié)果分別顯示,在SAA作用下,HUVECs發(fā)生明顯的遷移,并且相互連接構(gòu)成新生血管;上述結(jié)果在NFκB被抑制后,明顯受到抑制。結(jié)論1.TLR4在RA滑膜組織中呈高表達(dá),且TLR4表達(dá)的位置和量與OA組相比均有顯著差異,提示TLR4可能參與了RA的炎癥反應(yīng)和關(guān)節(jié)損傷。2.阻斷TLR4的作用能夠抑制SAA誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和新生血管形成,以及抑制內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生促進(jìn)血管新生的效應(yīng)分子,提示SAA-TLR4的相互作用在血管新生中發(fā)揮重要作用。3.SAA-TLR4-NFκB信號通路可能直接參與了RA血管新生-血管翳的形成,進(jìn)而造成RA患者關(guān)節(jié)軟骨及骨的破壞。
[Abstract]:Objective Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic inflammatory disease characterized by symmetrical polyarticular synovitis and angiogenesis. It has been shown that serum amyloid A (SAA) plays an important role in the pathogenesis of amyloid. In this study, we analyzed the expression of TLR4 in synovial tissue of RA patients, and further examined the effect of the interaction between SAA and TLR4 on HUVECs angiogenic factor VEGF,Ang-1,Ang-2. Finally, a three-dimensional vascular model was constructed in vitro to investigate the role of NF 魏 B signaling pathway mediated by SAA and TLR4 in the angiogenesis of RA. The purpose of this study was to explore the molecular mechanism of SAA promoting angiogenesis of RA and to find new and reliable targets for the clinical diagnosis and treatment of RA. Method 1. Immunohistochemical technique was used to detect the expression of TLR4 in synovial tissues of patients with RA and OA. HUVECs cell culture model, cell migration assay and MTT assay were used to analyze the effect of SAA and TLR4 interaction on endothelial cell migration and proliferation. Three-dimensional vascular model was established in vitro to analyze the effect of SAA / TLR4 interaction on endothelial cell neovascularization. 4. Elisa method was used to analyze the effect of SAA / TLR4 interaction on the production of angiogenic factors in endothelial cells. The effect of SAA-TLR4 interaction on the activation of NF 魏 B signaling pathway in human umbilical vein endothelial cells (HUVECs) was analyzed by western blot method. Result 1. Immunohistochemical results showed that TLR4 was widely expressed in the lining and sublining of RA synovial tissue, mainly in vascular endothelial cells, fibroblasts, macrophages and perivascular. However, in OA there was a small amount of expression in synovial lining layer and fibroblasts, and there was significant difference in the amount and position of expression between the two groups. The results of cell migration assay and three-dimensional vascular model in vitro showed that HUVECs could significantly promote the proliferation and migration of HUVECs, and interconnect with each other to form neovascularization, and after TLR4 was inhibited, SAA-mediated endothelial cell migration was induced. Proliferation and angiogenesis were significantly inhibited by Elisa. 3. The results of Elisa showed that HUVECs induced by SAA could produce VEGF,Ang-1,Ang-2 and other factors that could promote angiogenesis, while the production of TLR4 was significantly decreased after TLR4 was inhibited. The effects of other factors were not obvious. 4. The results of Western blot assay showed that HUVECs was significantly activated after SAA stimulation, but once TLR4 was inhibited, the activation of NF 魏 B was significantly inhibited. The results of cell migration experiment and three-dimensional vascular model in vitro showed that HUVECs migrated obviously and connected with each other to form neovascularization under the action of SAA, and the above results were obviously inhibited after NF 魏 B was inhibited. Conclusion there is a high expression of 1.TLR4 in RA synovium, and the location and quantity of TLR4 expression are significantly different from those in OA group, suggesting that TLR4 may be involved in the inflammatory reaction of RA and the injury of joint. 2. Blocking the effects of TLR4 can inhibit the proliferation, migration and angiogenesis of endothelial cells induced by SAA, and inhibit the production of angiogenic effector molecules by endothelial cells. The results suggest that the interaction of SAA-TLR4 may play an important role in angiogenesis. 3. SAA-TLR4-NF 魏 B signaling pathway may be directly involved in the formation of neovascularization and pannus of RA, which may lead to the destruction of articular cartilage and bone in RA patients.
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R593.22

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本文編號：2248483