【摘要】：目的:葡萄糖的衍生物糖化終末產(chǎn)物(AGEs)可促進代謝性炎癥的發(fā)生發(fā)展,但機制不清。本研究探討NLRP3炎癥小體在AGEs誘導(dǎo)胰島β細胞損傷中的作用。方法:在第一部分實驗中:(1)應(yīng)用NLRP3基因敲除(NLRP3 KO)和野生型C57BL/6J小鼠,給予甘油醛來源的AGEs(Gly AGEs)和BSA腹腔注射6周,測定葡萄糖耐量、胰島素釋放和胰島素耐量。收集標(biāo)本,HE染色觀察病理變化并行胰島炎評分,電鏡觀察超微結(jié)構(gòu),Tunel染色測定胰島細胞凋亡,免疫熒光觀察胰島素、胰高血糖素、IL-1b、NLRP3和F4/80染色。Western blot測定胰腺組織NLRP3炎癥小體和MCP-1蛋白表達,比色法測定caspase 1活性,ELISA測定MCP-1水平。(2)C57BL/6J小鼠Gly AGEs腹腔注射6周,氯膦酸脂質(zhì)體(COLD-lip)注射清除小鼠體內(nèi)巨噬細胞,進行相關(guān)檢測,指標(biāo)同前。(3)應(yīng)用Gly AGEs和不同干預(yù)措施(RAGE和NLRP3沉默及抗氧化劑NAC)分別處理MIN6、小鼠原代腹腔巨噬和RAW264.7細胞。測定細胞活性,ROS,細胞凋亡以及葡萄糖刺激的胰島素釋放。Western blot或real-time RT-PCR測定RAGE、NLRP3、ASC、caspase1和MCP-1表達,比色法測定caspase 1活性,ELISA法測定IL-1β分泌。在第二部分實驗中:(1)C57BL/6J小鼠分別腹腔注射BSA、Gly AGEs和葡萄糖來源的AGEs(Glu AGEs)6周后,進行相關(guān)檢測,指標(biāo)同前。(2)檢測孵育Gly AGEs和Glu AGEs后,NLRP3炎癥小體和MCP-1表達的變化。在第三部分實驗中:建立測定血漿中甲基乙二醛(MG)濃度的HPLC-MS/MS方法,并檢測初診T2DM患者血漿MG水平,評估MG和其它參數(shù)之間的關(guān)系。在第四部分實驗中:(1)NLRP3 KO和WT小鼠,給予甲基乙二醛來源的AGEs(MG AGEs)和BSA腹腔注射6周,進行相關(guān)檢測,指標(biāo)同前。(2)應(yīng)用MG AGEs和不同干預(yù)措施處理后,測定RAGE、ROS和NLRP3炎癥小體變化。結(jié)果:(1)腹腔注射Gly AGEs可誘導(dǎo)小鼠糖耐量損傷和糖負荷下胰島素釋放功能減低,并導(dǎo)致胰島β細胞凋亡增多,線粒體結(jié)構(gòu)改變。NLRP3 KO小鼠上述損傷減輕。(2)Gly AGEs激活小鼠胰腺NLRP3炎癥小體,胰島中巨噬細胞浸潤增多,胰島炎評分增高。NLRP3 KO小鼠caspase 1活性和IL-1β分泌降低,巨噬細胞浸潤減少。(3)COLD-lip清除巨噬細胞后改善Gly AGEs誘導(dǎo)的小鼠胰島功能和結(jié)構(gòu)損傷。(4)Gly AGEs使MIN6細胞活力降低,ROS升高,細胞凋亡增多和糖刺激下胰島素釋放能力損傷。NLRP3基因沉默后上述損傷未能改善。(5)Gly AGEs通過RAGE-ROS途徑激活巨噬細胞NLRP3炎癥小體。(6)Gly AGEs腹腔注射小鼠胰腺組織MCP-1蛋白表達和含量升高,NLRP3 KO小鼠部分減少。(7)Gly AGEs和IL-1β孵育顯著上調(diào)MIN6細胞MCP-1 mRNA表達。IL-1ra阻斷IL-1β上調(diào)的MCP-1 mRNA表達。(8)Gly AGEs激活巨噬細胞NLRP3炎癥小體并誘導(dǎo)巨噬細胞浸潤小鼠胰島的效應(yīng)較Glu AGEs更強,對小鼠胰島β細胞損傷作用更為顯著。(9)初診T2DM患者血漿MG水平顯著升高,且血漿MG含量與HbA1c和MDA均成正相關(guān)。(10)MG AGEs激活巨噬細胞NLRP3炎癥小體。NLRP3 KO亦能改善MG AGEs導(dǎo)致的小鼠胰島β細胞功能和結(jié)構(gòu)損傷。結(jié)論:AGEs導(dǎo)致小鼠胰島β細胞結(jié)構(gòu)和功能損傷與激活NLRP3炎癥小體有關(guān),NLRP3基因敲除能顯著改善AGEs誘導(dǎo)的小鼠胰島β細胞損害。Gly AGEs的在體毒性強于Gly AGEs,與其更強的激活NLRP3炎癥小體和誘導(dǎo)巨噬細胞浸潤胰島的效應(yīng)有關(guān)。初診2型糖尿病患者血漿中AGEs的前體MG水平升高,且MG與HbA1c和MDA成顯著正相關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1

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本文編號：2240279