【摘要】：目的應用慢病毒介導的RNA干擾技術,有效沉默連接紅色熒光蛋白mCherry與靶基因1型糖尿病易感基因Vβ13的表達,建立一種簡便有效基因沉默的系統(tǒng),并初步研究慢病毒感染T細胞的可能性。方法以Vβ13 mRNA編碼序列作為干擾靶點,以慢病毒質粒UTG作為載體,構建靶向Vβ13的shRNA表達質粒,構建攜帶Vβ13的m Cherry紅色熒光蛋白的質粒作為驗證shRNA有效性的靶點,并轉染293FT細胞。通過紅色熒光的表達及RT-PCR和Western blot確定最佳沉默Vβ13序列后,將有效的UTG-Vβ13質粒與輔助質粒共轉染293FT細胞,低溫超高速離心,獲取高滴度慢病毒。應用慢病毒感染大鼠T細胞,光鏡觀察T細胞被慢病毒感染的情況,流式細胞術檢測T細胞的綠色熒光表達情況。結果成功構建Vβ13-shRNA慢病毒載體UTG-shRNA-Vβ13,RT-PCR及Western blot結果顯示慢病毒感染的293FT細胞Vβ13 mRNA及蛋白表達相對于對照組顯著降低。構建的慢病毒可以成功感染T細胞。結論紅色靶基因-綠色慢病毒系統(tǒng)具有簡便的篩選性能;UTG慢病毒對神經干細胞具有較高感染效率�？勺鳛橐环N良好的基因導入載體,實現(xiàn)慢病毒介導的RNA干擾在T細胞內的有效表達,并為T細胞過繼性轉移的相關研究提供技術支持。
[Abstract]:Objective to effectively silence the expression of red fluorescent protein mCherry and target gene type 1 diabetes susceptibility gene V 尾 13 by lentivirus-mediated RNA interference, and to establish a simple and effective gene silencing system. The possibility of lentivirus infection with T cells was studied. Methods V 尾 13 mRNA coding sequence was used as interference target, lentivirus plasmid UTG was used as vector to construct shRNA expression plasmid targeting V 尾 13, and m Cherry red fluorescent protein carrying V 尾 13 was constructed as the target to verify the validity of shRNA, and 293FT cells were transfected. After the best silencing V 尾 13 sequence was determined by red fluorescence expression and RT-PCR and Western blot, the effective UTG-V 尾 13 plasmid was co-transfected into 293FT cells and centrifuged at low temperature and high speed to obtain high titer lentivirus. Rat T cells were infected with lentivirus. Light microscopy was used to observe the infection of T cells by lentivirus. Flow cytometry was used to detect the green fluorescence expression of T cells. Results RT-PCR and Western blot of V 尾 13-shRNA lentivirus vector UTG-shRNA-V 尾 13 showed that the expression of V 尾 13 mRNA and protein in 293FT cells infected by lentivirus was significantly lower than that in control group. The constructed lentivirus can successfully infect T cells. Conclusion the red target gene-green lentivirus system has a simple screening performance. UTG lentivirus has a high infection efficiency on neural stem cells. It can be used as a good gene transfer vector to realize the effective expression of lentivirus-mediated RNA interference in T cells and provide technical support for the study of T cell adoptive transfer.
【作者單位】： 濰坊醫(yī)學院病原生物學教研室;濰坊醫(yī)學院病理學教研室;濰坊醫(yī)學院生物科學與技術學院;
【基金】：國家自然科學基金資助項目(編號:81471048) 山東省自然科學基金資助項目(編號:ZR2012HL42,ZR2015HL064) 山東省高等學校科技計劃項目(編號:J12LK01) 濰坊醫(yī)學院大學生科技創(chuàng)新基金項目(編號:KX2016027)
【分類號】：R587.1

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本文編號：2162427