【摘要】：目的應(yīng)用慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾技術(shù),有效沉默連接紅色熒光蛋白mCherry與靶基因1型糖尿病易感基因Vβ13的表達(dá),建立一種簡便有效基因沉默的系統(tǒng),并初步研究慢病毒感染T細(xì)胞的可能性。方法以Vβ13 mRNA編碼序列作為干擾靶點(diǎn),以慢病毒質(zhì)粒UTG作為載體,構(gòu)建靶向Vβ13的shRNA表達(dá)質(zhì)粒,構(gòu)建攜帶Vβ13的m Cherry紅色熒光蛋白的質(zhì)粒作為驗(yàn)證shRNA有效性的靶點(diǎn),并轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞。通過紅色熒光的表達(dá)及RT-PCR和Western blot確定最佳沉默Vβ13序列后,將有效的UTG-Vβ13質(zhì)粒與輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293FT細(xì)胞,低溫超高速離心,獲取高滴度慢病毒。應(yīng)用慢病毒感染大鼠T細(xì)胞,光鏡觀察T細(xì)胞被慢病毒感染的情況,流式細(xì)胞術(shù)檢測T細(xì)胞的綠色熒光表達(dá)情況。結(jié)果成功構(gòu)建Vβ13-shRNA慢病毒載體UTG-shRNA-Vβ13,RT-PCR及Western blot結(jié)果顯示慢病毒感染的293FT細(xì)胞Vβ13 mRNA及蛋白表達(dá)相對(duì)于對(duì)照組顯著降低。構(gòu)建的慢病毒可以成功感染T細(xì)胞。結(jié)論紅色靶基因-綠色慢病毒系統(tǒng)具有簡便的篩選性能;UTG慢病毒對(duì)神經(jīng)干細(xì)胞具有較高感染效率�？勺鳛橐环N良好的基因?qū)胼d體,實(shí)現(xiàn)慢病毒介導(dǎo)的RNA干擾在T細(xì)胞內(nèi)的有效表達(dá),并為T細(xì)胞過繼性轉(zhuǎn)移的相關(guān)研究提供技術(shù)支持。
[Abstract]:Objective to effectively silence the expression of red fluorescent protein mCherry and target gene type 1 diabetes susceptibility gene V 尾 13 by lentivirus-mediated RNA interference, and to establish a simple and effective gene silencing system. The possibility of lentivirus infection with T cells was studied. Methods V 尾 13 mRNA coding sequence was used as interference target, lentivirus plasmid UTG was used as vector to construct shRNA expression plasmid targeting V 尾 13, and m Cherry red fluorescent protein carrying V 尾 13 was constructed as the target to verify the validity of shRNA, and 293FT cells were transfected. After the best silencing V 尾 13 sequence was determined by red fluorescence expression and RT-PCR and Western blot, the effective UTG-V 尾 13 plasmid was co-transfected into 293FT cells and centrifuged at low temperature and high speed to obtain high titer lentivirus. Rat T cells were infected with lentivirus. Light microscopy was used to observe the infection of T cells by lentivirus. Flow cytometry was used to detect the green fluorescence expression of T cells. Results RT-PCR and Western blot of V 尾 13-shRNA lentivirus vector UTG-shRNA-V 尾 13 showed that the expression of V 尾 13 mRNA and protein in 293FT cells infected by lentivirus was significantly lower than that in control group. The constructed lentivirus can successfully infect T cells. Conclusion the red target gene-green lentivirus system has a simple screening performance. UTG lentivirus has a high infection efficiency on neural stem cells. It can be used as a good gene transfer vector to realize the effective expression of lentivirus-mediated RNA interference in T cells and provide technical support for the study of T cell adoptive transfer.
【作者單位】： 濰坊醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)教研室;濰坊醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室;濰坊醫(yī)學(xué)院生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院;
【基金】：國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào):81471048) 山東省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(編號(hào):ZR2012HL42,ZR2015HL064) 山東省高等學(xué)�？萍加�(jì)劃項(xiàng)目(編號(hào):J12LK01) 濰坊醫(yī)學(xué)院大學(xué)生科技創(chuàng)新基金項(xiàng)目(編號(hào):KX2016027)
【分類號(hào)】：R587.1

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本文編號(hào)：2162427