【摘要】：背景:人免疫缺陷病毒(Human Immunodeficiency Virus,HIV)引起的獲得性免疫缺陷綜合征(Acquired immune deficiency syndrome,AIDS,又稱艾滋病)自20世紀(jì)80年代被發(fā)現(xiàn)以來迅速蔓延全球。近年來我國艾滋病新發(fā)病例上升的勢頭依然未能得到扭轉(zhuǎn),其中男男同性性行為人群(Men who have sex with men,MSM)疫情增長異常迅速,引起國內(nèi)外廣泛關(guān)注。中和抗體是機體針對HIV感染產(chǎn)生的主要免疫應(yīng)答,如何誘導(dǎo)正常人體產(chǎn)生可中和不同毒株的廣譜中和抗體(Broadly neutralizing antibodies,bNAbs)是設(shè)計、研發(fā)有效疫苗的基石和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。新近研究表明,我國MSM人群中HIV-1流行毒株不斷重組進(jìn)化和擴散,正在給相關(guān)抗體、藥物研究和應(yīng)用帶來重大挑戰(zhàn)。目的:深圳作為國內(nèi)MSM主要集散地和我國最大的口岸城市之一,建立bNAbs篩選分析平臺并應(yīng)用于本地MSM人群樣本,為下一步開展基于本地流行毒株的bNAbs機制和應(yīng)用研究奠定基礎(chǔ)。方法:第一部分為搭建HIV-1廣譜中和抗體篩查技術(shù)平臺。培養(yǎng)擴增含標(biāo)準(zhǔn)HIV-env基因的系列質(zhì)粒和骨架質(zhì)粒(含env以外的HIV基因),測序、酶切鑒定,然后分別將兩種質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞,制備具有單次感染能力的假病毒;通過TZM-bl細(xì)胞實驗檢測假病毒滴定度,計算半數(shù)細(xì)胞感染量(TCID50)。第二部分為所建平臺在本地MSM人群篩查中的初步應(yīng)用和驗證。包括建立小型MSM隊列,按計劃分別定期隨訪、留樣,測序分析人群中HIV-1病毒流行亞型;利用平臺篩選隊列人群樣本,檢測平臺的可行性;并對具有一定廣譜中和能力的代表性血樣進(jìn)行抗體競爭實驗初步分析其結(jié)合位點。結(jié)果:近年來,在深圳MSM人群中流行的HIV-1亞型CRF07_BC(43.4%)和CRF55_01B(15.4%)占比增長迅速。將來自該人群隊列的CRF07_BC感染者34人88份血樣進(jìn)行廣譜中和抗體檢測,篩選出具有一定廣譜中和抗性的血樣10份(ID50 Titer"g25),其中2例顯示了較佳中和寬度,可作用于全部12種假病毒中的7種(58.3%)。初步分析其結(jié)合機制均非靶向gp120。結(jié)論:隨著深圳地區(qū)MSM人群中的HIV-1毒株不斷進(jìn)化,其流行特性日益復(fù)雜,對其中增長迅速重組亞型的bNAbs相關(guān)研究亟待加強。通過本研究已成功建立小型MSM隊列和TZM-bl檢測分析技術(shù)平臺,并應(yīng)用于實踐,初步篩選結(jié)果提示部分具有中和活性的患者血清內(nèi)存在bNAbs。
[Abstract]:Background: acquired immunodeficiency syndrome (Acquired immune deficiency syndrome) caused by human immunodeficiency virus (Human Immunodeficiency) has spread rapidly all over the world since its discovery in 1980s. In recent years, the rising trend of new AIDS cases in China has not been reversed. The epidemic situation of men who have sex with men (Men who have sex with) has been increasing rapidly, which has attracted wide attention both at home and abroad. Neutralizing antibody is the main immune response to HIV infection. How to induce (Broadly neutralizing antibodiesbNAbs, which can neutralize different strains of virus, is the cornerstone and key link in the design and development of effective vaccine. Recent studies show that the continuous recombination, evolution and diffusion of HIV-1 epidemic strains in MSM populations in China are bringing great challenges to the research and application of related antibodies, drugs and drugs. Objective: as one of the main distribution centers of MSM in China and one of the largest port cities in China, Shenzhen established a bNAbs screening and analysis platform and applied it to local MSM samples, which laid a foundation for further research on the mechanism and application of bNAbs based on local epidemic strains. Methods: the first part is to set up HIV-1 wide-spectrum neutralizing antibody screening platform. A series of plasmids containing standard HIV-env gene and skeleton plasmids (including HIV gene other than env) were amplified, sequenced and identified by enzyme digestion. Then the two plasmids were co-transfected into 293T cells to prepare pseudovirus with single infection ability. The pseudoviral titer was detected by TZM-bl cell experiment, and the half cell infection dose (TCID50) was calculated. The second part is the preliminary application and validation of the platform in local MSM population screening. Small MSM cohort was set up, followed up regularly according to plan, samples were kept, HIV-1 virus epidemic subtypes were sequenced, and the platform was used to screen the samples of the cohort population to test the feasibility of the platform. The binding sites of representative blood samples with certain broad-spectrum neutralization ability were preliminarily analyzed by antibody competition test. Results: in recent years, the proportion of HIV-1 subtypes CRF07_BC (43.4%) and CRF55_01B (15.4%) in Shenzhen MSM population increased rapidly. Ten blood samples (ID50 Titer "g25) with certain broad-spectrum neutralization resistance were screened from 88 blood samples of 34 patients with CRF07_BC infection from this cohort. Two of them showed better neutralization width. It can act on 7 out of 12 pseudoviruses (58.3%). The binding mechanism of GP120 was preliminarily analyzed. Conclusion: with the continuous evolution of HIV-1 strains in MSM population in Shenzhen area, its epidemic characteristics are becoming more and more complicated, and the related studies on bNAbs subtypes, which are increasing rapidly, need to be strengthened. The small MSM cohort and TZM-bl detection and analysis platform have been successfully established and applied to practice. The preliminary screening results suggest that there is bNAbs in some patients with neutralizing activity.
【學(xué)位授予單位】：深圳大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R512.91

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本文編號：2161829