發(fā)布時(shí)間：2018-07-08 11:46

  本文選題：甲苯二異氰酸酯 + 職業(yè)性哮喘��； 參考：《濟(jì)南大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：【研究目的】1.采用氣管滴注的方式進(jìn)行激發(fā)給藥,改進(jìn)TDI哮喘小鼠模型建立的方案,并對(duì)模型的建立進(jìn)行評(píng)價(jià)。2.觀察TDI哮喘過程中ROR-γt、Foxp3、IL-17A和TSLP基因m RNA表達(dá)及其啟動(dòng)子區(qū)甲基化變化,探討TSLP及Th17/Treg細(xì)胞平衡在TDI哮喘發(fā)病中的作用。3.觀察TSLP中和抗體干預(yù)對(duì)TDI哮喘的治療作用以及TSLP與Th17/Treg細(xì)胞平衡間的相互作用,探討TDI哮喘的發(fā)病機(jī)制�！狙芯糠椒ā�1.動(dòng)物模型的建立選用SPF級(jí)健康雄性8-10周齡BALB/c小鼠20只,適應(yīng)環(huán)境1周后,隨機(jī)分為TDI哮喘組(TDI組)和溶劑對(duì)照組(AOO組)。TDI組小鼠于第1、8天耳背分別涂抹20μL 0.3%TDI致敏(溶劑為丙酮:橄欖油=2:3),第15天采用氣管滴注法給予20μL 0.01%TDI進(jìn)行激發(fā)(溶劑為丙酮:橄欖油=1:4)。AOO組小鼠,按照上述方法給予等量的溶劑。兩組小鼠在同樣的飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)并觀察小鼠一般生長狀況,每天測(cè)量小鼠體重。于TDI激發(fā)結(jié)束后24小時(shí)處死小鼠,每組各取6只小鼠檢測(cè)支氣管肺泡灌洗液(BALF)中細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞分類計(jì)數(shù)并將BALF中炎細(xì)胞涂片,采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)BALF白細(xì)胞介素4(IL-4)和IFN-γ水平的變化,每組另取4只小鼠多聚甲醛全身灌流固定后取部分肺組織蘇木素-伊紅(HE)染色觀察肺組織病理學(xué)改變。2.TSLP表達(dá)及Th17/Treg細(xì)胞平衡在TDI哮喘中的變化及其相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化改變模式選用SPF級(jí)健康雄性8-10周齡BALB/c小鼠32只,適應(yīng)環(huán)境1周后,隨機(jī)分為TDI組和AOO組。按上述方法建立TDI哮喘小鼠模型。于TDI激發(fā)結(jié)束后24小時(shí)處死小鼠,每組各取6只小鼠檢測(cè)BALF中細(xì)胞總數(shù)和細(xì)胞分類計(jì)數(shù),每組各取4只多聚甲醛全身灌流固定后取部分肺組織HE染色觀察氣管和肺組織病理學(xué)改變。每組各取6只小鼠部分肺組織,實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR和Mass Array飛行質(zhì)譜法分別檢測(cè)TDI組和AOO組小鼠肺組織中ROR-γt、Foxp3、IL-17A和TSLP基因mRNA和基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平。3.TSLP中和抗體干預(yù)對(duì)小鼠TDI哮喘的保護(hù)作用選用SPF級(jí)健康雄性8-10周齡BALB/c小鼠48只,適應(yīng)環(huán)境1周后,隨機(jī)分為TDI組、AOO組和TSLP中和抗體干預(yù)組(TSLP中和組),TDI組小鼠于第1、8天耳背分別涂抹20μL0.3%TDI致敏,(溶劑為丙酮:橄欖油=2:3),第15天采用氣管滴注法給予20μL 0.01%TDI進(jìn)行激發(fā)(溶劑為丙酮:橄欖油=1:4)。TSLP中和組在激發(fā)前30min給予TSLP中和抗體腹腔注射(15mg/kg),AOO組小鼠,按照上述方法給予等量的溶劑。三組小鼠在同樣的飼養(yǎng)條件下飼養(yǎng)并觀察小鼠一般生長狀況。于TDI激發(fā)結(jié)束后24小時(shí)處死小鼠,每組各取6只小鼠血清檢測(cè)Ig E水平的變化,同時(shí)取肺組織勻漿測(cè)IL-4、IFN-γ、IL-13的變化水平,每組各取4只小鼠多聚甲醛全身灌流固定后HE染色觀察三組小鼠氣管和肺組織病理學(xué)改變,每組各取6只小鼠的部分肺組織Western blot檢測(cè)TSLP蛋白的表達(dá)水平,其余部分肺組織用實(shí)時(shí)熒光定量逆轉(zhuǎn)錄RT-PCR法分別檢測(cè)肺組織中ROR-γt、Foxp3、IL-17A基因m RNA�！狙芯拷Y(jié)果】1.動(dòng)物模型的建立(1)經(jīng)TDI致敏激發(fā)后,TDI組10只小鼠均出現(xiàn)明顯的喘息、呼吸急促、點(diǎn)頭呼吸、弓背、前肢縮抬等哮喘癥狀,AOO組小鼠無明顯上述癥狀。與AOO組相比,TDI組小鼠實(shí)驗(yàn)前、后體重差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(2)兩組小鼠BALF中炎細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類及涂片結(jié)果:與AOO組相比,TDI組小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)、嗜中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞、嗜堿性粒細(xì)胞數(shù)目均明顯升高,嗜中性粒細(xì)胞百分比、嗜酸性粒細(xì)胞百分比均明顯升高,淋巴細(xì)胞百分比和單核細(xì)胞百分比均下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),與AOO組相比,TDI組BALF涂片中巨噬細(xì)胞、淋巴細(xì)胞所占的比例分別增加了4.6倍和4倍。(3)兩組小鼠BALF中細(xì)胞因子IL-4、IFN-γ水平比較結(jié)果:與AOO組相比,TDI組小鼠BALF中IL-4和IFN-γ水平均顯著升高(P0.01)。(4)兩組小鼠肺臟病理變化結(jié)果:AOO組小鼠肺組織內(nèi)支氣管腔未見滲出物,管壁及周圍組織無炎細(xì)胞浸潤,肺泡間隔未見增厚,無炎細(xì)胞浸潤,肺泡腔內(nèi)無滲出物;TDI組小鼠肺組織內(nèi)支氣管管壁破壞明顯,管腔增厚,支氣管管腔內(nèi)以及肺泡腔內(nèi)有大量的炎細(xì)胞浸潤。2.TSLP表達(dá)及Th17/Treg細(xì)胞平衡在TDI哮喘中的變化及其相關(guān)基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化改變模式(1)經(jīng)TDI致敏激發(fā)后,TDI組16只小鼠均出現(xiàn)明顯的喘息、呼吸急促、點(diǎn)頭呼吸、弓背、前肢縮抬等哮喘癥狀,AOO組小鼠無明顯上述癥狀。(2)兩組小鼠BALF中炎細(xì)胞計(jì)數(shù)、分類結(jié)果:與AOO組相比,TDI組小鼠BALF中白細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞百分比、嗜酸性粒細(xì)胞百分比均升高,淋巴細(xì)胞百分比和單核細(xì)胞百分比均下降,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(3)兩組小鼠氣管、肺臟病理變化結(jié)果:AOO組小鼠氣管管腔完整,無滲出物,未見炎細(xì)胞浸潤,粘膜上皮細(xì)胞無變性壞死脫落;TDI組小鼠氣管管腔變窄,管壁增厚,平滑肌增生,有大量炎細(xì)胞浸潤,炎細(xì)胞呈團(tuán)塊狀聚集,黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落;AOO組肺組織內(nèi)肺泡間隔未見增厚,無炎細(xì)胞浸潤,肺泡腔內(nèi)無滲出物。肺內(nèi)支氣管腔未見滲出物,管壁及周圍組織無炎細(xì)胞浸潤;TDI組小鼠肺泡間質(zhì)出現(xiàn)充血和水腫。肺內(nèi)支氣管管腔內(nèi)以及肺泡腔內(nèi)有大量的炎細(xì)胞浸潤,主要以嗜酸性粒細(xì)胞,中性粒細(xì)胞浸潤為主。(4)兩組小鼠肺組織中ROR-γt、IL-17A、Foxp3和TSLP基因m RNA表達(dá)水平比較:與AOO組相比,TDI組小鼠肺組織中Foxp3 m RNA相對(duì)表達(dá)水平下降,ROR-γt、IL-17A和TSLP的m RNA水平升高,差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。(5)兩組小鼠肺組織Foxp3、ROR-γt、IL-17A和TSLP基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平比較:與AOO組比較,TDI組小鼠肺組織中ROR-γt基因啟動(dòng)子區(qū)Cp G位點(diǎn)3、4、5、6、8、11和12的甲基化程度均下降(P0.05),IL-17A基因啟動(dòng)子區(qū)Cp G位點(diǎn)6、7的甲基化程度均下降(P0.01),Foxp3基因啟動(dòng)子區(qū)Cp G位點(diǎn)1和10的甲基化程度均升高(P0.01),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;未發(fā)現(xiàn)TDI組小鼠肺組織中TSLP基因啟動(dòng)子區(qū)Cp G位點(diǎn)發(fā)生明顯改變。3.TSLP中和抗體干預(yù)對(duì)小鼠TDI哮喘的保護(hù)作用(1)經(jīng)TDI致敏激發(fā)后,TDI組16只小鼠均出現(xiàn)明顯的喘息、呼吸急促、點(diǎn)頭呼吸、弓背、前肢縮抬等哮喘癥狀;TSLP中和組的哮喘癥狀比TDI組輕;AOO組小鼠無明顯上述癥狀。(2)三組小鼠血清中Ig E和肺組織勻漿中IFN-γ、IL-4、IL-13的細(xì)胞因子水平測(cè)定結(jié)果:與AOO組相比,TSLP中和組血清中的Ig E、肺組織勻漿中IL-13均升高(Z=-2.324,-2.324)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)肺組織勻漿中IFN-γ、IL-4差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);TDI組血清中的Ig E、肺組織勻漿中IFN-γ、IL-4、IL-13均升高(Z=-2.882,-2.882,-2.882,-2.882,)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);與TSLP中和組相比,TDI組血清中的Ig E、肺組織勻漿中IFN-γ、IL-4、IL-13均升高(Z=-2.324,-2.324,-2.324,-2.324,)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。(3)三組小鼠氣管、肺臟病理檢查結(jié)果:AOO組小鼠氣管管腔完整,無滲出物,未見炎細(xì)胞浸潤,粘膜上皮細(xì)胞無變性壞死脫落;TDI組小鼠氣管管腔變窄,管壁增厚,平滑肌增生,有大量炎細(xì)胞浸潤,炎細(xì)胞呈團(tuán)塊狀聚集,黏膜上皮細(xì)胞壞死脫落;相對(duì)于TDI組,TSLP中和組小鼠可顯著改善氣管周圍的炎癥浸潤、平滑肌的增生;AOO組肺組織內(nèi)肺泡間隔未見增厚,無炎細(xì)胞浸潤,肺泡腔內(nèi)無滲出物。肺內(nèi)支氣管腔未見滲出物,管壁及周圍組織無炎細(xì)胞浸潤;TDI組小鼠肺泡間質(zhì)出現(xiàn)充血和水腫。肺內(nèi)支氣管管腔內(nèi)以及肺泡腔內(nèi)有大量的炎細(xì)胞浸潤,主要以嗜酸性粒細(xì)胞,中性粒細(xì)胞浸潤為主。TSLP中和組與TDI組相比,肺泡間質(zhì)出現(xiàn)充血和水腫減輕,肺內(nèi)支氣管管腔內(nèi)以及肺泡腔內(nèi)有炎細(xì)胞的浸潤程度減輕。(4)western blot檢測(cè)三組小鼠肺臟TSLP的蛋白表達(dá)結(jié)果:與AOO組相比,TDI組小鼠TSLP水平相對(duì)表達(dá)量明顯增高,中和抗體干預(yù)后TSLP水平較TDI組可明顯下降。(5)三組小鼠肺組織中ROR-γt、IL-17A和Fox P3基因m RNA表達(dá)水平比較:與AOO組相比,TSLP中和組肺組織中ROR-γt、IL-17A基因m RNA水平升高(Z=-2.324,-2.324)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),肺組織中Fox P3基因m RNA表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);TDI組肺組織中ROR-γt、IL-17A基因m RNA表達(dá)水平升高(Z=-2.882,-2.882)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),肺組織中Fox P3基因m RNA表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);與TSLP中和組相比,TDI組肺組織中ROR-γt、IL-17A基因m RNA表達(dá)水平升高(Z=-2.324,-2.324)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),肺組織中Fox P3基因m RNA表達(dá)水平無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。【研究結(jié)論】1.利用氣管滴注的激發(fā)方式改良了TDI哮喘小鼠模型,保證了TDI哮喘模型的穩(wěn)定性和重復(fù)性。2.TSLP和Th17/Treg細(xì)胞失衡參與了TDI哮喘發(fā)病過程,ROR-γt、IL-17A和Foxp3基因啟動(dòng)子區(qū)域甲基化異�？赡軈⑴c了Th17/Treg細(xì)胞失衡的調(diào)控。3.利用TSLP中和抗體干預(yù)后,小鼠哮喘癥狀發(fā)生明顯緩解,并且干預(yù)組IL-17A及ROR-γt m RNA表達(dá)水平也比TDI哮喘組小鼠顯著降低,表明TSLP可作為TDI哮喘治療靶點(diǎn),并且這種治療作用可能通過抑制IL-17的表達(dá)發(fā)揮作用。
[Abstract]:The effects of TSLP and Th17 / Treg cell balance in the pathogenesis of TDI asthma were investigated . The effects of TSLP and Th17 / Treg cell balance on TDI asthma were investigated . Two groups of mice were given SPF healthy male 8 - 10 week - old BALB / c mice . The levels of IL - 4 , Foxp3 and IL - 13 in lung tissues were measured by Western blot . ( 3 ) Compared with AOO group , the levels of IL - 4 and IFN - 緯 in BALF were significantly increased compared with AOO group ( P0.01 ) . ( 3 ) The results of pathological changes of trachea and lung in the two groups showed that the trachea lumen of the AOO group was intact , no exudate , no inflammatory cell infiltration , no degeneration and necrosis of the mucosal epithelial cells , no inflammatory cell infiltration in the lung tissues of the TDI group , no inflammatory cell infiltration in the pulmonary tissues of the TDI group , no inflammatory cell infiltration in the lung tissues of the group of mice , no inflammatory cell infiltration in the lung tissues of the group of mice , no inflammatory cell infiltration in the lung tissues of the TDI group , no inflammatory cell infiltration in the lung tissues of the TDI group , no inflammatory cell infiltration in the lung tissues of the TDI group , no inflammatory cell infiltration in the lung tissues of the TDI group , no inflammatory cell infiltration in the lung tissues of the TDI group , and no inflammatory cell infiltration in the lung tissues of the TDI group . ( 5 ) Compared with the AOO group , the methylation degree of the promoter region Cp G of the promoter region of the TDI group decreased ( P0.01 ) , and the degree of methylation of the Cp G loci in the promoter region of the TDI group decreased ( P0.01 ) , and the degree of methylation of the promoter region Cp G of the IL - 17A gene was increased ( P0.01 ) . ( 2 ) The levels of IFN - 緯 , IL - 4 and IL - 13 in serum of three groups were significantly higher than those in group ( P0.05 ) . There was no significant difference in the levels of IFN - 緯 , IL - 4 and IL - 13 in the serum of TSLP ( P0.05 ) . ( 3 ) The results of pathological examination of trachea and lung in three groups of mice showed that the trachea lumen of the AOO group was intact , there were no exudate , no inflammatory cell infiltration , no degeneration and necrosis of the mucosal epithelial cells . There was no significant difference in mRNA expression level ( Z = - 2.324 , - 2.882 ) in lung tissue compared with that in the group of TSLP ( P0.05 ) .
【學(xué)位授予單位】：濟(jì)南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R562.25

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2107325