本文選題：急性高糖 + 腎小管　； 參考：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：目的:急性高糖的危害一方面和急性代謝紊亂所造成的一系列病理生理變化有關(guān),如糖尿病酮癥和糖尿病高滲性高糖狀態(tài);另外,還可一過性抑制胰島β細(xì)胞的胰島素分泌功能,即胰島β細(xì)胞“急性高糖毒性”。然而近期研究發(fā)現(xiàn),急性高糖還可導(dǎo)致急性“腎毒性”損傷。我們前期通過建立清醒大鼠急性高糖模型,發(fā)現(xiàn)急性高糖(16.7mmo/L)可導(dǎo)致大鼠明顯腎臟損傷,主要表現(xiàn)為不同程度的腎小管結(jié)構(gòu)和功能損傷,伴線粒體受損和氧化應(yīng)激反應(yīng)增強(qiáng),具體機(jī)制不清。細(xì)胞主要通過自噬清除受損細(xì)胞器等成分,自噬在急性器官損傷中起關(guān)鍵作用,線粒體自噬障礙可導(dǎo)致細(xì)胞ROS增多,加重細(xì)胞損傷。本研究擬在前期研究基礎(chǔ)上,進(jìn)一步探討:1.急性高糖導(dǎo)致大鼠腎小管損傷的濃度依賴關(guān)系。2.急性高糖導(dǎo)致大鼠腎小管損傷是否可逆。3.線粒體自噬及其調(diào)節(jié)通路AMPK-m TOR在急性高糖導(dǎo)致腎小管損傷中的作用機(jī)制。方法:1.以SD大鼠為研究對象:(1)急性高糖的濃度梯度研究:大鼠隨機(jī)分為四組:對照組,高糖組A(11.1mmol/L),高糖組B(16.7mmol/L)和高糖組C(25.0mmol/L),每組10只;(2)可逆性研究:大鼠隨機(jī)分為四組:對照組(生理鹽水),高糖組B(16.7mmol/L 6h,24h處死),高糖組B1(16.7mmol/L 6h,48h處死)和高糖組B2(16.7mmol/L 6h,72h處死),每組10只。2.大鼠麻醉后行頸靜脈置管術(shù),5天后行高糖鉗夾實(shí)驗(yàn)。高糖組大鼠50%葡萄糖溶液以0.25g/(kg·min)的速度泵入,使血糖迅速上升,后以一定速度持續(xù)泵入,每5min測定一次血糖,使血糖維持于目標(biāo)水平,對照組以同等速度泵入生理鹽水溶液,實(shí)驗(yàn)持續(xù)6h。3.留取血清及腎臟組織,光鏡和透射電鏡觀察腎小球、腎小管病理結(jié)構(gòu)變化;電鏡觀察腎小管上皮細(xì)胞自噬小體形成;生化法檢測大鼠血清肌酐、尿素氮、肌酐清除率和24h尿微量白蛋白(UMA)水平;生化法和ELISA方法檢測尿β2-微球蛋白(β2-MG)、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(NAG)、半乳糖苷酶(GAL)、中性粒細(xì)胞明膠酶相關(guān)載脂蛋白(NGAL)和胱抑素(Cys C)水平;Western blot及RT-PCR法檢測自噬指標(biāo)P62、LC3-II/LC3-I及線粒體自噬指標(biāo)BNIP3L/Nix的水平;Western blot及RT-PCR法檢測鈉葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SGLT-2的表達(dá);Western blot法檢測AMPK、m TOR磷酸化水平。4.以大鼠腎小管上皮細(xì)胞系NRK-52E細(xì)胞為研究對象,不同濃度葡萄糖(5.5mmol/L、11.1mmol/L、16.7mmol/L、25.0mmol/L)干預(yù)6h,MTT法檢測細(xì)胞活力;提取總RNA和總蛋白,RT-PCR及Western blot法檢測自噬指標(biāo)P62、LC3-II/LC3-I及線粒體自噬指標(biāo)BNIP3L/Nix的水平,Western blot及RT-PCR法檢測鈉葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SGLT-2的表達(dá);Western blot法檢測AMPK、mTOR磷酸化水平。5.線粒體自噬調(diào)節(jié)通路細(xì)胞實(shí)驗(yàn):設(shè)置對照組(5.5mmol/L),高糖組B(16.7mmol/L),AMPK激動(dòng)劑組(16.7mmol/L葡萄糖+AICAR)和m TOR抑制劑組(16.7mmol/L葡萄糖+雷帕霉素),分別干預(yù)6h,提取細(xì)胞總RNA和總蛋白,Western blot及RT-PCR法檢測自噬指標(biāo)P62、LC3-II/LC3-I及線粒體自噬指標(biāo)BNIP3L/Nix的水平;Western blot及RT-PCR法檢測鈉葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SGLT-2的表達(dá);Western blot法檢測AMPK、m TOR磷酸化水平。結(jié)果:1.成功建立大鼠急性高糖模型,高糖組大鼠血糖分別維持于11.1mmol/L,16.7mmol/L、25.0mmol/L左右,對照組大鼠血糖維持于4-6 mmol/L。2.HE染色:11.1mmol/L的急性高糖即可導(dǎo)致大鼠腎小管上皮細(xì)胞腫脹、結(jié)構(gòu)紊亂,且損傷隨血糖濃度升高逐漸加重;電鏡結(jié)果示三個(gè)不同濃度的急性高糖均可導(dǎo)致大鼠腎小球足突局灶性融合、內(nèi)皮細(xì)胞膜孔開大,部分細(xì)胞核呈凋亡樣改變,腎小管上皮細(xì)胞迷路結(jié)構(gòu)不清晰,線粒體嵴結(jié)構(gòu)不清晰,出現(xiàn)自噬泡、自噬溶酶體,且隨血糖濃度升高,自噬泡、自噬溶酶體有逐漸增多的趨勢。3.HE染色示解除高糖作用24h后,觀察到腎小管上皮細(xì)胞腫脹、管腔狹窄最為明顯,隨著時(shí)間延長(48h,72h)腎小管損傷逐漸減輕,但未完全恢復(fù)至正常(72h腎小管仍有輕度腫脹);電鏡結(jié)果示急性高糖干預(yù)后,24h、48h時(shí)觀察到腎小球足突融合、內(nèi)皮細(xì)胞凋亡、腎小管排列紊亂、線粒體腫脹等損傷最為明顯;與48h和24h相比,72h時(shí)腎小球、腎小管損傷有減輕的趨勢,但未完全恢復(fù)至正常(腎小球仍有部分足突融合、內(nèi)皮細(xì)胞膜孔開大,腎小管線粒體輕度腫脹)。4.與對照組相比,三組不同濃度急性高糖均可導(dǎo)致正常大鼠24h尿UMA明顯增加(P0.05),但對血肌酐、尿素氮和肌酐清除率等未見明顯影響(P0.05);腎小管上皮細(xì)胞損傷的指標(biāo)NAG、NGAL、GAL、Cys C、及β2-MG有不同程度升高(P0.05)。5.正常大鼠經(jīng)16.7mmol/L的急性高糖干預(yù)6h后去除高糖作用,進(jìn)一步觀察腎臟損傷的可逆性變化:與對照組相比,24h時(shí)大鼠24h尿UMA明顯增加(32.37±3.65 vs 10.25±0.84μg/24h,P0.05),72h時(shí)呈下降趨勢(12.15±1.34vs 32.37±3.65μg/24h,P0.05);但對血肌酐、尿素氮和肌酐清除率等未見明顯影響(P0.05);腎小管上皮細(xì)胞損傷的指標(biāo)NAG、NGAL、GAL、Cys C及β2-MG在24h時(shí)明顯升高(P0.05),72h時(shí)出現(xiàn)下降,但與對照組相比,并未完全恢復(fù)(NAG 10.58±2.38 vs 4.85±3.75 U/L,P0.05;NGAL 1.63±0.56vs 0.72±0.11 ng/m L,P0.05;GAL 22.49±5.98 vs 16.50±0.71 U/L,P0.05;Cys C 123.01±17.24 vs 24.93±12.69 ng/m L,P0.05;β2-MG 0.043±0.010 vs0.026±0.011 mg/L,P0.05)。6.與對照組相比,三個(gè)不同濃度急性高糖均可導(dǎo)致大鼠自噬指標(biāo)P62表達(dá)增加、LC3-II/LC3-I比值降低、線粒體自噬指標(biāo)BNIP3L/Nix的表達(dá)增加(P0.05),SGLT-2的表達(dá)增加、AMPK磷酸化水平下降、m TOR磷酸化水平上升(P0.05)。7.不同濃度急性高糖可上調(diào)NRK-52E細(xì)胞自噬指標(biāo)P62表達(dá),下調(diào)LC3-II/LC3-I比值,上調(diào)線粒體自噬相關(guān)指標(biāo)BNIP3L/Nix、SGLT-2的表達(dá)及m TOR磷酸化水平,下調(diào)AMPK磷酸化水平(P0.05)。8.與高糖組(16.7mmol/L)相比,AMPK激動(dòng)劑和m TOR抑制劑均可上調(diào)自噬相關(guān)指標(biāo)LC3-II/LC3-I比值,下調(diào)自噬指標(biāo)P62及線粒體自噬指標(biāo)BNIP3L/Nix表達(dá)(P0.05)。結(jié)論:1.急性高糖可導(dǎo)致腎臟結(jié)構(gòu)和功能損傷,這種損傷在血糖濃度達(dá)到11.1mmol/L時(shí)即已出現(xiàn),且以腎小管損傷為主;急性高糖導(dǎo)致的腎臟損傷呈濃度依賴性,即血糖濃度越高損傷越重。2.急性高糖導(dǎo)致的腎小管損傷具有可逆性,隨著解除高糖作用時(shí)間的延長,腎小管損傷逐漸恢復(fù)。3.在急性高糖導(dǎo)致的腎小管損傷中,腎小管上皮細(xì)胞線粒體自噬受到抑制,且與血糖濃度相關(guān),血糖濃度越高,線粒體自噬抑制程度越重。4.AMPK/m TOR信號(hào)通路參與急性高糖導(dǎo)致的腎小管上皮細(xì)胞線粒體自噬的抑制調(diào)節(jié)。
[Abstract]:Objective : To study the effects of acute high glucose on renal tubular injury in rats . The expression of SGLT - 2 was detected by Western blot and RT - PCR . Western blot and RT - PCR were used to detect the levels of self - phagocytic index P62 , LC3 - II / LC3 - I and mitochondrial autophagy index BPN33L / Nix . Western blot and RT - PCR were used to detect the levels of self - phagocytic index P62 , LC3 - II / LC3 - I and mitochondrial autophagy index BPN33L / Nix . Western blot and RT - PCR were used to detect the expression of SGLT - 2 . The results of electron microscopy showed that acute hyperglycose at 24 h and 48 h could result in a significant increase in renal tubular epithelial cells ( P < 0.05 ) , but not completely recovered to normal ( after 48 h , 72 h ) . 鍙?qiáng)危?

本文編號(hào)：2082586