本文選題：微囊泡 + 顆粒細胞�。� 參考：《安徽醫(yī)科大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：第一部分人臍帶間充質(zhì)干細胞來源微囊泡的分離純化目的:建立一個高效人臍帶間充質(zhì)干細胞來源微囊泡的分離純化方法。方法:收集第3代至第8代間充質(zhì)干細胞上清液,分別采用差速離心法,改良超速離心法,蔗糖梯度純化法提取MVs,Bradford法蛋白定量,共聚焦顯微鏡及透射電鏡觀察MVs的形態(tài)學(xué)特征。結(jié)果:改良超速離心方法MVs的蛋白含量顯著高于傳統(tǒng)差速離心方法和蔗糖梯度純化法,每1×106個細胞大約釋放162μg左右的MVs。電鏡下MVs直徑介于30-200nm之間,呈單層膜、類圓形囊泡結(jié)構(gòu),中間為低電子致密物質(zhì)。結(jié)論:改良超速離心法能獲得高蛋白濃度的微囊泡。第二部分微囊泡對化療損傷卵巢顆粒細胞的保護作用目的:探討MSCs來源MVs對化療損傷顆粒細胞的保護作用。方法:1.機械分離法分離3周SD雌性大鼠卵巢顆粒細胞,原代無血清培養(yǎng),FSHR免疫熒光鑒定顆粒細胞的純度;將PKH26標(biāo)記的MVs添加入正常顆粒細胞以及順鉑損傷顆粒細胞中,6h后熒光顯微鏡觀察MVs在顆粒細胞的定位;將不同濃度MVs與顆粒細胞共培養(yǎng),確定最佳MVs作用濃度。2.實驗分組:實驗分為正常顆粒細胞組(GCs)、順鉑組(CTx)和順鉑+微囊泡組(MVs+CTx);MTT法檢測各組細胞存活率;化學(xué)發(fā)光法檢測各組培養(yǎng)液上清雌二醇和孕酮濃度;Annexin V-FITC/PI雙染流式細胞儀檢測各組顆粒細胞凋亡率;實時熒光定量PCR檢測各組顆粒細胞凋亡相關(guān)基因(Bax、Bcl-2、Caspase3)以及類固醇急性調(diào)節(jié)蛋白基因(St AR)的表達水平。結(jié)果:1.無血清培養(yǎng)的大鼠卵巢顆粒細胞生長良好,免疫熒光染色證實本研究所獲顆粒細胞純度達95%以上;MVs在共培養(yǎng)6h后,損傷顆粒細胞中可見紅色熒光標(biāo)記的MVs。2.MVs與化療損傷顆粒細胞共培養(yǎng)后,顆粒細胞凋亡率明顯減少,雌激素水平明顯升高,顆粒細胞凋亡相關(guān)基因Caspase3的表達水平顯著降低,Bcl-2與Bax比值及St AR基因表達水平顯著升高,且MVs對化療損傷顆粒細胞的保護作用呈濃度依賴性。結(jié)論:MVs能進入化療損傷的顆粒細胞中,在體外能夠減輕顆粒細胞的損傷,促進損傷顆粒細胞增殖和分泌功能的恢復(fù)。
[Abstract]:The first part: isolation and purification of microcapsules derived from human umbilical cord mesenchymal stem cells objective: to establish an efficient method for isolation and purification of human umbilical cord mesenchymal stem cells derived from microcapsules. Methods: the supernatants of mesenchymal stem cells from the third to the eighth generation were collected. The MVs were extracted by differential centrifugation, modified ultracentrifugation and sucrose gradient purification. The morphologic characteristics of MVs were observed by confocal microscope and transmission electron microscope. Results: the protein content of MVs by modified ultracentrifugation was significantly higher than that by conventional differential centrifugation and sucrose gradient purification, and about 162 渭 g MVsper 1 脳 106 cells were released. Under electron microscope, the diameter of MVs is between 30-200nm, monolayer membrane, circular vesicle structure and low electron dense material in the middle. Conclusion: the modified ultracentrifugation method can obtain microvesicles with high protein concentration. The second part was the protective effect of microvesicles on ovarian granulosa cells induced by chemotherapy. Objective: to investigate the protective effect of MSCs derived from MVs on granulosa cells induced by chemotherapy. Method 1: 1. The ovarian granulosa cells of SD female rats were isolated by mechanical separation for 3 weeks, and the purity of granulosa cells was identified by FSHR immunofluorescence in primary serum-free culture. After adding PKH26 labeled MVs into normal granulosa cells and cisplatin damaged granulosa cells for 6 h, the localization of MVs in granulosa cells was observed by fluorescence microscope, and the optimal concentration of MVs was determined by co-culture of different concentrations of MVs with granulosa cells. The experiment was divided into normal granulosa cell group (GCs), cisplatin group (CTX) and cisplatin microvesicular group (MVs CTX). The concentration of estradiol and progesterone in supernatant of each group was detected by chemiluminescence assay. The apoptosis rate of granulosa cells in each group was detected by flow cytometry with Annexin V-FITC / Pi double staining. The expression of apoptosis-related gene (Bax-Bcl-2Caspase3) and steroid acute regulatory protein gene (St AR) in granulosa cells were detected by real-time fluorescent quantitative PCR. The result is 1: 1. The granulosa cells of rat ovary cultured in serum-free medium grew well. Immunofluorescence staining confirmed that the purity of granulosa cells in this study was over 95%, and MVs was cocultured for 6 h. After co-culture of red fluorescent labeled MVs.2.MVs and chemotherapy-injured granulosa cells, the apoptotic rate of granulosa cells was significantly decreased, and the level of estrogen was significantly increased. The expression of apoptosis-related gene Caspase3 significantly decreased the ratio of Bcl-2 to Bax and the expression of St AR gene, and the protective effect of MVs on granulosa cells was concentration-dependent. ConclusionMVs can enter the granulosa cells injured by chemotherapy, which can attenuate the injury of granulosa cells in vitro and promote the recovery of proliferation and secretory function of injured granulosa cells.
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R711.75

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本文編號：2078739