本文選題：環(huán)瓜氨酸肽 + 抗環(huán)瓜氨酸肽抗體　； 參考：《鄭州大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：目的:抗環(huán)瓜氨酸肽(cyclic citrullinated peptide,CCP)抗體由類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoid arthritis,RA)患者B細(xì)胞分泌,對RA早期診斷具有特異性,同時對預(yù)測骨損傷程度及RA臨床預(yù)后評估有重要價值。本研究擬建立一種檢測人血清中抗CCP抗體含量的膠體金定量檢測方法,為該病的預(yù)警診斷及預(yù)后評估提供一種技術(shù)手段,以此來推動該疾病特異性檢測方法的進(jìn)步。方法:1.通過人工合成技術(shù)合成CCP多肽,經(jīng)碳二亞胺偶聯(lián)技術(shù)使CCP多肽與牛血清白蛋白(BSA)偶聯(lián),優(yōu)化最佳偶聯(lián)條件,對偶聯(lián)產(chǎn)物應(yīng)用紫外(UV)法、SDS-PAGE進(jìn)行鑒定、利用間接酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)進(jìn)行生物活性檢測,確定最適CCP多肽偶聯(lián)物。2.研制用于定量檢測血清中抗CCP抗體含量的膠體金試紙條。通過對膠體金顆粒、標(biāo)記pH優(yōu)化、標(biāo)記最低抗體量優(yōu)化、免疫金保護液pH值優(yōu)化、試紙條材料的選擇與處理、最佳包被量的確定等方面研究,對試紙條性能從線性范圍、精密性、穩(wěn)定性、回收率及臨床樣本的檢測等方面進(jìn)行評價。初步建立人血清抗CCP抗體膠體金定量檢測方法。結(jié)果:1.確定CCP-BSA偶聯(lián)12 h為最佳偶聯(lián)用時,獲得可與抗CCP抗體特異結(jié)合的CCP-BSA偶聯(lián)物,經(jīng)檢測鑒定確定偶聯(lián)成功、產(chǎn)物有效,可用于制備膠體金試紙條。2.本研究建立的間接膠體金定量檢測方法的工藝技術(shù)條件為:氯金酸與檸檬酸三鈉體積比1:1.5制備的膠體金效果最佳;膠體金溶液保存最佳條件為加入0.05%的疊氮鈉;標(biāo)記時1 mL膠體金溶液加入3μL 0.2 mol/mL K2CO3,最低標(biāo)記抗體量為8.8μg;免疫金保護液最佳pH為8.8;質(zhì)控線包被羊抗鼠IgG最佳濃度為1.0 mg/mL;檢測線包被CCP-BSA偶聯(lián)抗原最佳濃度為1.5 mg/mL;包被緩沖液中蔗糖含量0.4%;金墊鋪金量為400μL/10cm,金標(biāo)定量儀讀數(shù)時間為試劑反應(yīng)后14min。3.建立的膠體金定量檢測方法性能指標(biāo)為:線性范圍50~500 RU/mL,R2=0.993,精密性質(zhì)控品L1批內(nèi)CV=2.6%,批間CV=4.52%;精密性質(zhì)控品L2批內(nèi)CV=2.5%,批間CV=4.28%,高值、中值、低值血清的回收率分別為100.96%、97.17%、91.46%,用40份臨床樣本與國外試劑盒平行測試,結(jié)果表明兩者具有相關(guān)性,回歸方程:Y=1.004X+7.968,R2=0.955。結(jié)論:1.利用碳化二亞胺偶聯(lián)技術(shù)成功將CCP多肽與BSA大分子偶聯(lián),且偶聯(lián)產(chǎn)物可與抗CCP抗體特異性結(jié)合。2.建立了一種人血清抗CCP抗體膠體金定量檢測方法,可初步應(yīng)用于臨床對抗CCP抗體的定量檢測,為RA的臨床早期預(yù)警診斷及預(yù)后評估提供技術(shù)支撐。
[Abstract]:Objective: the anti-cyclic citrullinated peptide antibody secreted by B cells in patients with rheumatoid arthritis (RA) is specific to the early diagnosis of RA, and has important value in predicting the degree of bone injury and evaluating the clinical prognosis of RA. The aim of this study was to establish a colloidal gold quantitative assay for the detection of anti-CCP antibody in human serum in order to provide a technical means for the early warning diagnosis and prognosis evaluation of the disease, so as to promote the progress of the specific detection method for the disease. Method 1: 1. CCP peptide was synthesized by artificial synthesis and coupled with bovine serum albumin (BSA) by carbodiimide coupling technique. The optimum coupling conditions were optimized. The coupling product was identified by UV UV) method. The bioactivity of ELISAwas determined by indirect enzyme-linked immunosorbent assay (Elisa). A colloidal gold strip for quantitative determination of anti CCP antibody in serum was developed. Through the study of colloidal gold particles, labeling pH optimization, labeling minimum antibody quantity optimization, immune gold protection solution pH value optimization, selection and treatment of test strip material, determination of optimal coating amount, etc., the performance of test strip was linearly studied. Accuracy, stability, recovery and clinical sample detection were evaluated. A method for quantitative determination of colloidal gold with anti CCP antibody in human serum was established. The result is 1: 1. CCP-BSA conjugate was obtained when CCP-BSA was used for 12 h. The conjugate of CCP-BSA was successfully coupled with anti-CCP antibody. The product was effective and could be used to prepare colloidal gold strip. 2. The technological conditions of the indirect colloidal gold quantitative determination method are as follows: the colloidal gold prepared by the volume ratio of chlorgold acid and trisodium citrate 1: 1.5, the best condition of colloidal gold solution preservation is the addition of 0.05% sodium azide; When 1 mL colloidal gold solution was added 3 渭 L 0.2 mol / mL K _ 2CO _ 3, the lowest labeled antibody was 8.8 渭 g, the best pH of immunogold protection solution was 8.8, the best concentration of goat anti-mouse IgG was 1.0 mg / mL, the best concentration of CCP-BSA coupling antigen was 1.5 mg 路mL ~ (-1), the best concentration of goat anti-mouse IgG was 1.0 mg 路mL ~ (-1), the best concentration of CCP-BSA conjugated antigen was 1.5 mg 路mL ~ (-1). The content of sucrose in buffer solution was 0.4 and the amount of gold covered with gold was 400 渭 L / 10 cm. The reading time of gold calibrator was 14min. 3 after reagent reaction. The performance indexes of the established colloidal gold quantitative detection method are as follows: linear range 50 ~ 500 RUR / mL ~ (2 +) 0.993, precision property control L _ (1) C _ (2) C _ (2) C _ (2) C _ (2.5), interlot CVN _ (4.28), high value, median value, interlot CVN _ (4.52), precision property control L _ (2), CVI ~ (2) / R _ (2) = 0.993, precision property control L _ (1), The recoveries of low value serum were 100.96 and 97.177.171.46, respectively. 40 clinical samples were tested in parallel with foreign kits. The results showed that there was a correlation between the two. The regression equation was Y: 1.004X 7.298 R2O0.955. Conclusion 1. CCP peptide was successfully coupled with BSA macromolecule by carbonized diimide coupling technique, and the coupling product could specifically bind to anti-CCP antibody. A method for quantitative detection of anti-CCP antibody colloidal gold in human serum was established. It can be applied to the quantitative detection of anti-CCP antibody in clinic and provide technical support for clinical early warning diagnosis and prognosis evaluation of RA.
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R593.22

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本文編號：2014477