本文選題：BV2小膠質(zhì)細胞 + 原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞��； 參考：《南昌大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：研究背景:目前,由人類免疫缺陷病毒(Human immunodeficiency virus,HIV)感染引起的艾滋病癡呆綜合癥(AIDS-dementia complex,ADC)具體機制尚不清楚。已有研究顯示,巨噬細胞和小膠質(zhì)細胞(Macrophage and microglia,M phi)活化釋放的炎性因子和過氧化物等有害物質(zhì)對中樞神經(jīng)系統(tǒng)(Central nervous system,CNS)內(nèi)的其他細胞產(chǎn)生損害或?qū)е录毎蛲龅然顒訁⑴cADC的病理生理過程。HIV-1病毒包膜糖蛋白-120(Glycoprotein-120,gp120)是引起神經(jīng)毒性反應(yīng)的主要病毒分子之一,在病毒識別與結(jié)合宿主細胞表面受體等方面具有重要作用。研究發(fā)現(xiàn),在體或側(cè)腦室注射gp120可造成新生或成年大鼠腦損傷,且M phi的活化與gp120的神經(jīng)毒性有關(guān)。P2X7受體涉及炎癥和免疫反應(yīng),在調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞的功能活動中具有重要作用,并與神經(jīng)退行性疾病密切相關(guān)。三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate,ATP)可通過激活P2X7受體活化小膠質(zhì)細胞,從而引起炎性因子釋放。以上研究表明,P2X7受體可能成為ADC防治的新靶點。柚皮苷(Naringin)是一類天然黃酮類物質(zhì),具有抗炎、抗氧化應(yīng)激、糖脂代謝調(diào)節(jié)及心肌保護等特性,提示柚皮苷可能對P2X7受體介導(dǎo)的gp120所致小膠質(zhì)細胞損傷有一定的保護效應(yīng)。因此,研究柚皮苷是否對P2X7受體介導(dǎo)的gp120所致小膠質(zhì)細胞損傷起保護作用,對擴寬柚皮苷的應(yīng)用范圍和探索ADC潛在的治療手段等方面具有重要意義。目的:本研究應(yīng)用gp120處理小膠質(zhì)細胞建立細胞損傷模型,在細胞水平上研究P2X7受體是否參與gp120誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞損傷以及柚皮苷的保護作用。方法:本課題研究對象為BV2小膠質(zhì)細胞株和大鼠原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞。應(yīng)用MTS法檢測各濃度gp120對BV2小膠質(zhì)細胞活性的影響;通過MTS或TUNEL法檢測BV2小膠質(zhì)細胞/原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞的損傷或凋亡情況;通過免疫細胞化學(xué)或免疫熒光雙標(biāo)法分別檢測BV2小膠質(zhì)細胞/原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞P2X7受體的表達;通過qPCR(Quantitative real-time PCR,q PCR)和Western Blot分別檢測BV2小膠質(zhì)細胞/原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞P2X7 mRNA和受體蛋白及BV2小膠質(zhì)細胞P65 NF-κB的表達;應(yīng)用試劑盒檢測BV2小膠質(zhì)細胞上清液中NO的含量及細胞內(nèi)ROS的水平,并分別檢測了BV2小膠質(zhì)細胞/原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞上清液中TNF-α、IL-1β或eATP的含量。結(jié)果:1.通過免疫熒光法檢測小膠質(zhì)細胞特異性標(biāo)志物CD11b,結(jié)果發(fā)現(xiàn)BV2小膠質(zhì)細胞/原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞純度分別在99%和90%以上,完全符合后期實驗要求。2.gp120建模濃度篩選:MTS結(jié)果顯示,與Ctrl組相比,濃度為1.0μg/L的gp120處理組細胞活性在90%以上(P0.05),2.0μg/L處理組細胞活性為80%左右(P0.01),而4.0μg/L和8.0μg/L處理組細胞活性均降至60%以下(P0.01);BV2小膠質(zhì)細胞P2X7 mRNA和受體蛋白表達的檢測結(jié)果顯示,在一定濃度范圍內(nèi),隨著gp120濃度增加,BV2小膠質(zhì)細胞P2X7 mRNA和受體蛋白的表達水平呈上升趨勢,且2.0μg/L濃度的gp120能使細胞P2X7 mRNA和受體蛋白表達顯著上調(diào)。因此,選用2.0μg/L濃度的gp120用于建立小膠質(zhì)細胞損傷模型。3.柚皮苷用藥濃度篩選:MTS結(jié)果顯示,1μM濃度柚皮苷處理組細胞活性與Ctrl組相比無明顯差異(P0.05),10μM和100μM處理組細胞活性約在95-75%之間,而1000μM處理組的細胞明顯大量死亡;以gp120為模型在10-160μM之間設(shè)置柚皮苷濃度梯度,結(jié)果顯示,40μM柚皮苷開始對細胞活性產(chǎn)生保護效應(yīng),與Ctrl組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);而80μM柚皮苷具有顯著性差異(P0.01),故以此柚皮苷濃度用于實驗。4.MTS檢測BV2小膠質(zhì)細胞活性:與Ctrl組相比,gp120組和gp120+PBS組BV2小膠質(zhì)細胞活性顯著下降(P0.01);與gp120組相比,gp120+Naringin組和gp120+BBG組BV2小膠質(zhì)細胞活性均有所升高(P0.05),且此兩組間無明顯差異(P0.05)。5.TUNEL檢測原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞凋亡:與Ctrl組相比,gp120可引起原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞大量凋亡(P0.01);而柚皮苷對gp120所致的原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞凋亡有一定的保護作用(P0.01),DMSO作為柚皮苷藥物溶劑對本實驗無明顯影響(P0.05)。6.BV2小膠質(zhì)細胞P2X7 mRNA/受體和P65 NF-κB的表達:PCR、Western Blot和免疫組化結(jié)果顯示,gp120組和gp120+PBS組的P2X7受體表達與Ctrl組相比均顯著上調(diào)(P0.01),gp120+BBG組表達量明顯下降(P0.01),且BBG組與Ctrl組之間無明顯差異(P0.05);與gp120組相比,gp120+Naringin組的P2X7 mRNA和受體蛋白及P65 NF-κB表達均明顯下降(P0.01)。7.原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞P2X7 mRNA和受體檢測結(jié)果:gp120組細胞P2X7mRNA和受體蛋白的表達均明顯高于Ctrl組(P0.01),且與gp120+DMSO溶劑對照組無明顯差異(P0.05);與gp120組相比,gp120+Naringin組P2X7 mRNA和受體蛋白的表達明顯降低(P0.01)。8.BV2小膠質(zhì)細胞過氧化物和炎性因子檢測結(jié)果:與Ctrl組相比,gp120組BV2小膠質(zhì)細胞上清液中NO、TNF-α和IL-1β含量增加及細胞內(nèi)ROS升高,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);gp120+Naringin組細胞上清液中NO含量與gp120組相比顯著下降(P0.01)。9.大鼠原代培養(yǎng)小膠質(zhì)細胞eATP、TNF-α和IL-1β檢測結(jié)果:與Ctrl組相比,gp120組細胞上清液中eATP、TNF-α和IL-1β含量均顯著增加(P0.01),而gp120+Naringin組eATP、TNF-α和IL-1β含量與gp120組相比均明顯下降,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05或0.01)。結(jié)論:HIV-1病毒包膜糖蛋白gp120可引起小膠質(zhì)細胞損傷/凋亡;P2X7受體介導(dǎo)gp120所致小膠質(zhì)細胞損傷/凋亡,且柚皮苷對其具有一定的保護作用。
[Abstract]:Objective : To study whether naringin is a new target for the prevention and treatment of microglial cells . The results showed that the activity of BV2 microglial cells / primary cultured microglial cells was more than 90 % ( P0.05 ) . The results showed that the activity of BV2 microglial cells / primary cultured microglial cells was higher than that in control group ( P0.05 ) . Conclusion : HIV - 1 virus envelope glycoprotein pl2 can induce the injury / apoptosis of microglial cells .
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R512.91

【參考文獻】

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本文編號：2003951