本文選題：骨橋蛋白 + 糖尿病�。� 參考：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：糖尿病患者血糖升高是促進其血管并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要因素,而血管并發(fā)癥是糖尿病患者致殘、致死的主要原因。骨橋蛋白(OPN)是血管并發(fā)癥中動脈粥樣斑塊形成的重要因素,在糖尿病患者血漿和動脈斑塊中表達增加,高血糖可促進平滑肌細胞和內(nèi)皮細胞中OPN的表達,但其表達調(diào)控機制尚不清楚。FoxO1是叉頭框轉(zhuǎn)錄因子家族Fox O亞家族的一員,被認(rèn)為與糖尿病胰島素抵抗密切相關(guān)。在本課題中,我們選取小鼠巨噬細胞RAW 264.7為細胞模型,通過高糖培養(yǎng)基刺激培養(yǎng)和過表達FoxO1,檢測OPN的mRNA和蛋白表達水平,及培養(yǎng)上清中的OPN濃度,Western blot檢測FoxO1的磷酸化水平。通過構(gòu)建3組FoxO1特異性的shRNA表達載體,進一步檢測FoxO1的表達抑制對OPN表達的作用�？寺『蜆�(gòu)建了小鼠OPN的啟動子區(qū)熒光素酶報告基因載體,分別通過高糖刺激和Fox O1的shRNA干擾,檢測其啟動子區(qū)的活性變化。通過EMSA實驗和Ch IP實驗進一步確定Fox O1與OPN啟動子區(qū)的結(jié)合情況。通過本課題的研究,我們發(fā)現(xiàn)高糖可誘導(dǎo)小鼠巨噬細胞RAW 264.7中OPN的表達上調(diào)及抑制FoxO1的磷酸化;通過過表達FoxO1,發(fā)現(xiàn)野生型和激活型FoxO1可促進OPN的表達,而失活型FoxO1減弱OPN的表達;通過shRNA介導(dǎo)的Fox O1表達下調(diào),OPN的表達水平隨之下調(diào)。為進一步明確其機制,我們克隆獲得了小鼠的OPN啟動子區(qū)序列,發(fā)現(xiàn)其活性主要集中于-1918~-713區(qū)段,其中包含10個FBE位點;而-713~+79區(qū)段不包含F(xiàn)BE位點,活性很低。同時高糖刺激和shRNA干擾實驗進一步證實,高糖可激活-1918~-713區(qū)段的轉(zhuǎn)錄活性,而FoxO1被干擾后可抑制該區(qū)段的活性。EMSA實驗和ChIP實驗進一步證實了FoxO1可與OPN啟動子區(qū)結(jié)合。我們的研究結(jié)果為糖尿病血管并發(fā)癥的發(fā)病機制提供了一條新的線索,并有望作為臨床上一種潛在的血管病變風(fēng)險評價指標(biāo)。
[Abstract]:Hyperglycemia is an important factor to promote the occurrence and development of diabetic vascular complications, and vascular complications are the main cause of disability and death in diabetic patients. Osteopontin (OPN) is an important factor in atherosclerotic plaque formation in vascular complications. The expression of osteopontin in plasma and atherosclerotic plaques is increased in diabetic patients. Hyperglycemia can promote the expression of OPN in smooth muscle cells and endothelial cells. However, the mechanism of its expression regulation is not clear. FoxO1 is a member of the Fox O subfamily of the fork frame transcription factor family, which is considered to be closely related to insulin resistance in diabetes mellitus. In this study, we selected mouse macrophage RAW 264.7 as cell model, stimulated and overexpressed FoxO1 in high glucose medium, detected the expression of mRNA and protein in OPN, and detected the phosphorylation level of FoxO1 in the culture supernatant by Western blot. Three groups of FoxO1 specific shRNA expression vectors were constructed to detect the effect of FoxO1 expression inhibition on OPN expression. The luciferase reporter gene vector of mouse OPN promoter region was cloned and constructed. The activity of the promoter region was detected by high glucose stimulation and shRNA interference of Fox O1, respectively. The binding of Fox O 1 to OPN promoter region was further determined by EMSA and Ch IP experiments. In this study, we found that high glucose could induce the up-regulation of OPN expression and inhibit the phosphorylation of FoxO1 in mouse macrophage RAW 264.7, and by overexpressing FoxO1, we found that wild type and activated type FoxO1 could promote the expression of OPN. But inactivated FoxO1 attenuated the expression of OPN, and the expression of Fox O1 was down-regulated by shRNA mediated expression of Fox O1. In order to further clarify its mechanism, we cloned the mouse OPN promoter sequence and found that its activity was mainly concentrated in the -1918 ~ 713 region, which contained 10 FBE loci, while the -713 ~ 79 region did not contain the FBE site, and its activity was very low. At the same time, hyperglycemic stimulation and shRNA interference experiments further confirmed that high glucose could activate the transcriptional activity of the -1918C-713 region, while FoxO1 could inhibit the activity of this region. EMSA and ChIP experiments further confirmed that FoxO1 could bind to OPN promoter region. Our results provide a new clue for the pathogenesis of diabetic vascular complications and may be used as a potential risk indicator for vascular diseases.
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.2

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本文編號：1946149