本文選題：PKR + 蛋白結(jié)合功能��； 參考：《南京醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：目的:PKR(dsRNA-dependent protein kinase)是胞內(nèi)模式識(shí)別受體,也是絲/蘇蛋白激酶,被發(fā)現(xiàn)參與了外周組織的胰島素抵抗(insulin resistance),和中心組織胰島β細(xì)胞周期阻滯,在調(diào)控機(jī)體胰島β細(xì)胞整體功能失代償和2型糖尿病發(fā)生過程中具有至關(guān)重要的作用。除了激酶活性,PKR還有蛋白結(jié)合功能,而其對(duì)胰島β細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)并不清楚。本研究旨在探討PKR蛋白結(jié)合功能對(duì)胰島β細(xì)胞增殖的分子機(jī)制。方法:采用Coumermycin/GyrB-PKR-K296H融合基因截短體體系,在胰島β細(xì)胞(MIN6細(xì)胞和原代胰島)中構(gòu)建PKR蛋白結(jié)合功能上調(diào)模型,即在激酶活性未活化的情況下,單因素研究PKR蛋白結(jié)合功能。免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)檢測(cè)PKR與TRAF2/3/6的蛋白結(jié)合變化;免疫印跡檢測(cè)PKR過表達(dá)后其底物eIFα的磷酸化水平。噻唑藍(lán)(MTT)法、EdU熒光標(biāo)記和流式細(xì)胞術(shù)分別評(píng)價(jià)胰島β細(xì)胞的生長(zhǎng)活力、細(xì)胞增殖及周期進(jìn)程的變化。Real-time RT-PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定細(xì)胞周期蛋白cyclin D1、cyclinD2、CDK2、CDK4、c-Myc和p21、p27以及p53的mRNA和蛋白水平。轉(zhuǎn)染si-c-Myc,si-TRAF2,si-TRAF6,si-RIP1的小干擾RNA或給予NFκB抑制劑(Bay11-7082)預(yù)處理;核質(zhì)分離研究細(xì)胞核p65的蛋白水平;免疫熒光實(shí)驗(yàn)觀察NFκB(p65)的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)定位;熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)(Luciferase Assay)分析NFκB的轉(zhuǎn)錄活性。轉(zhuǎn)染全長(zhǎng)PKR-K296R后,辨析糖脂毒性或炎癥因子刺激對(duì)MIN6細(xì)胞PKR蛋白結(jié)合功能的影響。結(jié)果:Coumermycin/GyrB-PKR-K296H融合基因截短體體系成功構(gòu)建了胰島β細(xì)胞無激酶活性的PKR蛋白結(jié)合功能上調(diào)模型;PKR蛋白結(jié)合功能可以促進(jìn)胰島β細(xì)胞生存活力,增殖和G1/S期轉(zhuǎn)換;并能誘導(dǎo)c-Myc的m RNA和蛋白水平顯著上調(diào),而對(duì)cyclin D1、cyclinD2、CDK2、CDK4和p21、p27以及p53無明顯影響;c-Myc的上調(diào)依賴于NFκB的轉(zhuǎn)錄活性;而PKR蛋白結(jié)合功能上調(diào)伴隨NFκB的活化;si-TRAF2而不是si-TRAF6能顯著阻斷PKR蛋白結(jié)合功能介導(dǎo)的NFκB轉(zhuǎn)錄活性、c-myc上調(diào)和胰島β細(xì)胞增殖;PKR蛋白結(jié)合功能也能誘導(dǎo)RIP1的泛素化并參與TRAF2調(diào)控的胰島β細(xì)胞促增殖作用;而PKR蛋白結(jié)合功能也能緩解糖脂毒性和炎癥因子誘導(dǎo)的胰島β細(xì)胞生長(zhǎng)抑制。結(jié)論:PKR蛋白結(jié)合結(jié)合功能能通過促進(jìn)細(xì)胞周期G1/S轉(zhuǎn)化來刺激胰島β細(xì)胞增殖,這與周期相關(guān)蛋白c-Myc的表達(dá)上調(diào)密切聯(lián)系。NFκB的轉(zhuǎn)錄活性參與了PKR蛋白結(jié)合功能誘導(dǎo)的c-Myc基因表達(dá);PKR通過募集TRAF2來激活下游信號(hào)分子,泛素化RIP1并激活NFκB轉(zhuǎn)錄活性。本論文研究揭示了PKR蛋白結(jié)合功能通過TRAF2/RIP1/NFκB/c-Myc信號(hào)通路,促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖的新調(diào)控機(jī)制。結(jié)合我們已有的研究,抑制或下調(diào)PKR的激酶活性,而保留PKR蛋白結(jié)合功能,能促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖,為改善2型糖尿病的藥物治療提供新的思路。
[Abstract]:Objective: PKRdsRNA-dependent protein kinase, an intracellular pattern recognition receptor and silk / statin kinase, has been found to be involved in insulin resistance in peripheral tissues and in central islet 尾 cell cycle arrest. It plays an important role in regulating the overall functional decompensation of islet 尾 cells and the development of type 2 diabetes. In addition to kinase activity PKR has protein binding function and its regulation on islet 尾-cell function is not clear. The aim of this study was to investigate the molecular mechanism of PKR binding function on the proliferation of islet 尾 cells. Methods: Coumermycin/GyrB-PKR-K296H fusion gene truncation system was used to construct the up-regulation model of PKR protein binding function in islet 尾 -cell line (Mn-6 cells and primary islets). That is to say, without activation of kinase activity, univariate study of PKR protein binding function was carried out. The protein binding between PKR and TRAF2/3/6 was detected by co-immunoprecipitation, and the phosphorylation level of eIF 偽 was detected by Western blot. The growth activity of islet 尾 cells was evaluated by fluorescence labeling and flow cytometry. The changes of cell proliferation and cell cycle progression. Real-time RT-PCR and Western blot assay were used to determine the mRNA and protein levels of cyclin D 1, cyclin D 2, CDK2, CDK4, c Myc, p21 and p27, and p53, respectively. Transfection of si-c-Mycnsi-TRAF2si-TRAF6si-RIP1 or pretreatment with NF 魏 B inhibitor Bay11-7082; nuclear and cytoplasmic separation to study the protein level of nuclear p65; immunofluorescence assay to observe the subcellular structure localization of NF 魏 B p65; luciferase reporter gene assay Luciferase Assayase to analyze the transcriptional activity of NF 魏 B. After transfection of full-length PKR-K296R, the effects of glycolipid toxicity or inflammatory factor stimulation on the binding function of PKR protein in MIN6 cells were analyzed. Results in the truncated body system of the fusion gene of 1: Coumermycin / GyrB-PKR-K296H, a model of up-regulation of PKR protein binding function without kinase activity in islet 尾 cells was successfully constructed, which could promote the viability, proliferation and G 1 / S phase transition of islet 尾 cells. In addition, the m RNA and protein levels of c-Myc were significantly up-regulated, but the up-regulation of cyclin D1cyclin D2CDK2 + CDK4, p21 p27 and p53 was dependent on the transcriptional activity of NF 魏 B. However, the up-regulation of PKR protein binding function associated with the activation of NF 魏 B, and not si-TRAF6, could significantly block the up-regulation of NF 魏 B transcriptional activity mediated by PKR protein binding function and the proliferation of islet 尾 cells. It could also induce the Ubiquigenation of RIP1. And TRAF2 induced proliferation of islet 尾 cells; The binding function of PKR protein also alleviated the growth inhibition of islet 尾 cells induced by glycolipid toxicity and inflammatory factors. Conclusion the cell cycle G1 / S transformation can stimulate the proliferation of islet 尾 cells by the binding function of the protein: PKR. This is closely related to the up-regulation of cyclin c-Myc expression. NF 魏 B is involved in the expression of c-Myc gene induced by PKR protein binding function. PKR activates downstream signaling molecules by recruiting TRAF2, Ubiquitin RIP1 and NF 魏 B transcriptional activity. This study revealed a new regulatory mechanism of PKR protein binding through the TRAF2/RIP1/NF 魏 B/c-Myc signaling pathway to promote the proliferation of islet 尾 cells. In combination with our previous studies, inhibition or down-regulation of PKR kinase activity and preservation of PKR protein binding function can promote the proliferation of islet 尾 cells and provide new ideas for the improvement of drug therapy for type 2 diabetes.
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R587.1

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 ;“瑞金國(guó)際內(nèi)分泌論壇-胰島β細(xì)胞研究”會(huì)訊及征文通知(第二輪)[J];中華內(nèi)分泌代謝雜志;2006年04期

2 合湫;蘇恒;;胰島β細(xì)胞損傷的分子機(jī)制探討[J];實(shí)用糖尿病雜志;2011年06期

3 楊淑秋;;胰島β細(xì)胞瘤[J];廣西醫(yī)學(xué);1987年01期

4 韓鳳蘭;胰島β細(xì)胞瘤(附13例臨床分析)[J];廣東醫(yī)學(xué);1988年04期

5 童名瑞,田新良;睜眼昏迷1月的胰島β細(xì)胞癌1例報(bào)告[J];新醫(yī)學(xué);1988年09期

6 邱子謙;楊傳之;劉廣和;;誤診為癔病的胰島β細(xì)胞瘤2例[J];臨床誤診誤治;1988年03期

7 張瑞軍;胰島β細(xì)胞瘤1例[J];山東醫(yī)藥;1997年08期

8 蔣旭超;謝志芳;章衛(wèi)平;;胰島β細(xì)胞發(fā)育與再生的研究進(jìn)展[J];中國(guó)病理生理雜志;2013年10期

9 逄曙光,孫金鳳;胰島β細(xì)胞瘤5例誤診原因分析[J];山東醫(yī)藥;2000年11期

10 郝淑梅,蔣丹峰;長(zhǎng)期誤診的胰島β細(xì)胞瘤1例報(bào)告[J];中國(guó)綜合臨床;2000年04期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 費(fèi)玉娥;金雪光;;屢次誤診為竭癥的胰島β細(xì)胞瘤一例[A];2006年浙江省精神病學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2006年

2 劉靜;田利民;郭茜;王銳;樊瀛哲;余燁;;大鼠內(nèi)嗎啡肽對(duì)胰島β細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[A];2006年中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病分會(huì)第十次全國(guó)糖尿病學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2006年

3 林建立;侯建明;高政南;陳剛;黃慧彬;溫俊平;梁繼興;;應(yīng)用細(xì)胞片層技術(shù)研究胰島β細(xì)胞的細(xì)胞保護(hù)[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十一次全國(guó)內(nèi)分泌學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2012年

4 龍健;蘇艷新;鄧華聰;;脂聯(lián)素抗胰島β細(xì)胞脂性凋亡及其機(jī)制[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第十一次全國(guó)內(nèi)分泌學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2012年

5 李珊珊;孔德明;李雪梅;;使用遺傳學(xué)可示蹤轉(zhuǎn)基因斑馬魚技術(shù)進(jìn)行甲硝唑誘導(dǎo)胰島β細(xì)胞破壞和再生的初步研究[A];2010年貴州省中西醫(yī)結(jié)合學(xué)會(huì)內(nèi)分泌學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2010年

6 鹿國(guó)暉;曾凡星;方子龍;;注射重組人生長(zhǎng)激素對(duì)運(yùn)動(dòng)大鼠胰島β細(xì)胞形態(tài)和功能的影響[A];2002年第9屆全國(guó)運(yùn)動(dòng)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2002年

7 張宏利;駱天紅;馮齡;趙臾;李文毅;徐佳;李杲;羅敏;;多發(fā)性內(nèi)分泌腫瘤1型基因?qū)σ葝uβ細(xì)胞發(fā)育和分化作用的研究[A];2006年中華醫(yī)學(xué)會(huì)糖尿病分會(huì)第十次全國(guó)糖尿病學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2006年

8 周琳;薛耀明;沈潔;高方;;胰淀素對(duì)體外培養(yǎng)胰島β細(xì)胞胰島素分泌影響的分子機(jī)制[A];中華醫(yī)學(xué)會(huì)第六次全國(guó)內(nèi)分泌學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2001年

9 李淼;何清華;國(guó)漢邦;黃秀清;滿永;路永剛;周迎生;王抒;黎健;;低密度脂蛋白與極低密度脂蛋白引起胰島β細(xì)胞氧化損傷作用的機(jī)制探討[A];第四屆全國(guó)血脂分析與臨床學(xué)術(shù)研討會(huì)暨第九屆全國(guó)脂蛋白學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2008年

10 趙玉峰;裴建明;朱運(yùn)龍;陳晨;;亞油酸通過雙信號(hào)途徑激活大鼠胰島β細(xì)胞上ATP敏感性鉀通道[A];2008年神經(jīng)內(nèi)分泌暨神經(jīng)免疫內(nèi)分泌學(xué)術(shù)研討會(huì)論文摘要匯編[C];2008年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前10條

1 記者 白毅;調(diào)控胰島β細(xì)胞代償性增殖新機(jī)制被發(fā)現(xiàn)[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2014年

2 吳一福;僵知飲對(duì)胰島β細(xì)胞損傷有修復(fù)作用[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2005年

3 馮衛(wèi)東;外分泌細(xì)胞直接轉(zhuǎn)化胰島β細(xì)胞獲得成功[N];科技日?qǐng)?bào);2008年

4 解放軍總醫(yī)院內(nèi)分泌科主任醫(yī)師 潘長(zhǎng)玉;降糖同時(shí)勿忽略胰島β細(xì)胞[N];健康報(bào);2010年

5 中山大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)分泌科主任醫(yī)師 程樺 教授;兒童糖尿病患病率明顯增加[N];健康時(shí)報(bào);2008年

6 ;一線降糖藥物存在嚴(yán)重先天不足[N];衛(wèi)生與生活報(bào);2007年

7 本報(bào)記者　趙紹華;關(guān)于“干細(xì)胞移植治愈糖尿病”[N];健康時(shí)報(bào);2003年

8 鄭倩怡;腸促胰素研究帶來降糖新理念[N];中國(guó)醫(yī)藥報(bào);2010年

9 陳金偉;藥名差以毫厘 藥效失之千里[N];保健時(shí)報(bào);2007年

10 吳紀(jì);營(yíng)造生命的春天[N];大眾科技報(bào);2000年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 陳志紅;攜有鼠胰島素樣生長(zhǎng)因子1重組腺病毒對(duì)胰島β細(xì)胞的保護(hù)性研究[D];山東大學(xué);2009年

2 凌家儉;一氧化氮在胰島β細(xì)胞內(nèi)對(duì)環(huán)加氧酶2表達(dá)、前列腺素E2合成的影響及前列腺素E2引起胰島β細(xì)胞功能紊亂作用機(jī)制的研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2005年

3 李敏;高遷移率族蛋白1在1型糖尿病鼠胰島β細(xì)胞損傷中的作用機(jī)制[D];復(fù)旦大學(xué);2012年

4 龍健;脂聯(lián)素抑制胰島β細(xì)胞脂性凋亡及其機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2012年

5 陳文斌;表觀遺傳調(diào)控對(duì)胰島β細(xì)胞發(fā)育和功能以及糖尿病發(fā)病的影響和機(jī)制[D];山東大學(xué);2013年

6 盧忠燕;FOXO1轉(zhuǎn)錄因子在胰島β細(xì)胞中的作用及機(jī)制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2009年

7 孫中華;實(shí)驗(yàn)性糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞凋亡、再生與氧化自由基、TGF-β相關(guān)因子的研究[D];吉林大學(xué);2004年

8 付青姐;IL-1β誘導(dǎo)后NIT-1胰島β細(xì)胞差異表達(dá)基因的分離、監(jiān)定和序列分析[D];中國(guó)人民解放軍第一軍醫(yī)大學(xué);2003年

9 解秀文;腺病毒介導(dǎo)胰島素樣生長(zhǎng)因子1基因?qū)︽滊遄艟刂麓笫笠葝uβ細(xì)胞損害的保護(hù)性作用[D];青島大學(xué);2010年

10 谷昭艷;Annexin 1對(duì)增齡相關(guān)胰島β細(xì)胞增殖與自噬功能的影響及機(jī)制探討[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2012年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 甘秋蘭;西格列汀拮抗糖尿病胰島β細(xì)胞炎癥反應(yīng)及與Keap1-Nrf2-ARE通路的關(guān)系[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

2 唐冉琪;基于靶點(diǎn)PTP1B的胰島β細(xì)胞保護(hù)的實(shí)驗(yàn)研究及抗代謝綜合征藥物篩選[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2015年

3 苗天翼;蘋果多酚基于GLP-1受體途徑降糖作用的機(jī)制研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

4 張建偉;亮氨酸對(duì)2型糖尿病的影響[D];蘇州大學(xué);2015年

5 劉潺潺;抵當(dāng)芪桂湯對(duì)糖尿病大鼠FFA、ADPN及胰島β細(xì)胞結(jié)構(gòu)影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];陜西中醫(yī)藥大學(xué);2015年

6 謝心苗;Irisin與betatrophin的關(guān)系以及對(duì)β細(xì)胞增殖作用的研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

7 邢云芝;沙格列汀通過抑制SDF-1α降解促進(jìn)2型糖尿病大鼠胰島β細(xì)胞增殖作用的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2015年

8 高麗麗;PKR蛋白結(jié)合功能促進(jìn)胰島β細(xì)胞增殖機(jī)制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2015年

9 宛曉夢(mèng);PKR激活通過SUMO化修飾上調(diào)P53抑制胰島β細(xì)胞增殖[D];南京醫(yī)科大學(xué);2015年

10 焦成;慢性間歇性低氧下mTOR信號(hào)通路變化對(duì)大鼠胰島β細(xì)胞數(shù)量的影響[D];南京醫(yī)科大學(xué);2015年

，

本文編號(hào)：1925462