本文選題：PKR + 蛋白結合功能　； 參考：《南京醫(yī)科大學》2015年碩士論文

【摘要】：目的:PKR(dsRNA-dependent protein kinase)是胞內模式識別受體,也是絲/蘇蛋白激酶,被發(fā)現(xiàn)參與了外周組織的胰島素抵抗(insulin resistance),和中心組織胰島β細胞周期阻滯,在調控機體胰島β細胞整體功能失代償和2型糖尿病發(fā)生過程中具有至關重要的作用。除了激酶活性,PKR還有蛋白結合功能,而其對胰島β細胞功能的調節(jié)并不清楚。本研究旨在探討PKR蛋白結合功能對胰島β細胞增殖的分子機制。方法:采用Coumermycin/GyrB-PKR-K296H融合基因截短體體系,在胰島β細胞(MIN6細胞和原代胰島)中構建PKR蛋白結合功能上調模型,即在激酶活性未活化的情況下,單因素研究PKR蛋白結合功能。免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)檢測PKR與TRAF2/3/6的蛋白結合變化;免疫印跡檢測PKR過表達后其底物eIFα的磷酸化水平。噻唑藍(MTT)法、EdU熒光標記和流式細胞術分別評價胰島β細胞的生長活力、細胞增殖及周期進程的變化。Real-time RT-PCR和Western blot實驗分別測定細胞周期蛋白cyclin D1、cyclinD2、CDK2、CDK4、c-Myc和p21、p27以及p53的mRNA和蛋白水平。轉染si-c-Myc,si-TRAF2,si-TRAF6,si-RIP1的小干擾RNA或給予NFκB抑制劑(Bay11-7082)預處理;核質分離研究細胞核p65的蛋白水平;免疫熒光實驗觀察NFκB(p65)的亞細胞結構定位;熒光素酶報告基因實驗(Luciferase Assay)分析NFκB的轉錄活性。轉染全長PKR-K296R后,辨析糖脂毒性或炎癥因子刺激對MIN6細胞PKR蛋白結合功能的影響。結果:Coumermycin/GyrB-PKR-K296H融合基因截短體體系成功構建了胰島β細胞無激酶活性的PKR蛋白結合功能上調模型;PKR蛋白結合功能可以促進胰島β細胞生存活力,增殖和G1/S期轉換;并能誘導c-Myc的m RNA和蛋白水平顯著上調,而對cyclin D1、cyclinD2、CDK2、CDK4和p21、p27以及p53無明顯影響;c-Myc的上調依賴于NFκB的轉錄活性;而PKR蛋白結合功能上調伴隨NFκB的活化;si-TRAF2而不是si-TRAF6能顯著阻斷PKR蛋白結合功能介導的NFκB轉錄活性、c-myc上調和胰島β細胞增殖;PKR蛋白結合功能也能誘導RIP1的泛素化并參與TRAF2調控的胰島β細胞促增殖作用;而PKR蛋白結合功能也能緩解糖脂毒性和炎癥因子誘導的胰島β細胞生長抑制。結論:PKR蛋白結合結合功能能通過促進細胞周期G1/S轉化來刺激胰島β細胞增殖,這與周期相關蛋白c-Myc的表達上調密切聯(lián)系。NFκB的轉錄活性參與了PKR蛋白結合功能誘導的c-Myc基因表達;PKR通過募集TRAF2來激活下游信號分子,泛素化RIP1并激活NFκB轉錄活性。本論文研究揭示了PKR蛋白結合功能通過TRAF2/RIP1/NFκB/c-Myc信號通路,促進胰島β細胞增殖的新調控機制。結合我們已有的研究,抑制或下調PKR的激酶活性,而保留PKR蛋白結合功能,能促進胰島β細胞增殖,為改善2型糖尿病的藥物治療提供新的思路。
[Abstract]:Objective: PKRdsRNA-dependent protein kinase, an intracellular pattern recognition receptor and silk / statin kinase, has been found to be involved in insulin resistance in peripheral tissues and in central islet 尾 cell cycle arrest. It plays an important role in regulating the overall functional decompensation of islet 尾 cells and the development of type 2 diabetes. In addition to kinase activity PKR has protein binding function and its regulation on islet 尾-cell function is not clear. The aim of this study was to investigate the molecular mechanism of PKR binding function on the proliferation of islet 尾 cells. Methods: Coumermycin/GyrB-PKR-K296H fusion gene truncation system was used to construct the up-regulation model of PKR protein binding function in islet 尾 -cell line (Mn-6 cells and primary islets). That is to say, without activation of kinase activity, univariate study of PKR protein binding function was carried out. The protein binding between PKR and TRAF2/3/6 was detected by co-immunoprecipitation, and the phosphorylation level of eIF 偽 was detected by Western blot. The growth activity of islet 尾 cells was evaluated by fluorescence labeling and flow cytometry. The changes of cell proliferation and cell cycle progression. Real-time RT-PCR and Western blot assay were used to determine the mRNA and protein levels of cyclin D 1, cyclin D 2, CDK2, CDK4, c Myc, p21 and p27, and p53, respectively. Transfection of si-c-Mycnsi-TRAF2si-TRAF6si-RIP1 or pretreatment with NF 魏 B inhibitor Bay11-7082; nuclear and cytoplasmic separation to study the protein level of nuclear p65; immunofluorescence assay to observe the subcellular structure localization of NF 魏 B p65; luciferase reporter gene assay Luciferase Assayase to analyze the transcriptional activity of NF 魏 B. After transfection of full-length PKR-K296R, the effects of glycolipid toxicity or inflammatory factor stimulation on the binding function of PKR protein in MIN6 cells were analyzed. Results in the truncated body system of the fusion gene of 1: Coumermycin / GyrB-PKR-K296H, a model of up-regulation of PKR protein binding function without kinase activity in islet 尾 cells was successfully constructed, which could promote the viability, proliferation and G 1 / S phase transition of islet 尾 cells. In addition, the m RNA and protein levels of c-Myc were significantly up-regulated, but the up-regulation of cyclin D1cyclin D2CDK2 + CDK4, p21 p27 and p53 was dependent on the transcriptional activity of NF 魏 B. However, the up-regulation of PKR protein binding function associated with the activation of NF 魏 B, and not si-TRAF6, could significantly block the up-regulation of NF 魏 B transcriptional activity mediated by PKR protein binding function and the proliferation of islet 尾 cells. It could also induce the Ubiquigenation of RIP1. And TRAF2 induced proliferation of islet 尾 cells; The binding function of PKR protein also alleviated the growth inhibition of islet 尾 cells induced by glycolipid toxicity and inflammatory factors. Conclusion the cell cycle G1 / S transformation can stimulate the proliferation of islet 尾 cells by the binding function of the protein: PKR. This is closely related to the up-regulation of cyclin c-Myc expression. NF 魏 B is involved in the expression of c-Myc gene induced by PKR protein binding function. PKR activates downstream signaling molecules by recruiting TRAF2, Ubiquitin RIP1 and NF 魏 B transcriptional activity. This study revealed a new regulatory mechanism of PKR protein binding through the TRAF2/RIP1/NF 魏 B/c-Myc signaling pathway to promote the proliferation of islet 尾 cells. In combination with our previous studies, inhibition or down-regulation of PKR kinase activity and preservation of PKR protein binding function can promote the proliferation of islet 尾 cells and provide new ideas for the improvement of drug therapy for type 2 diabetes.
【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1

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