本文選題：Graves病 + 調(diào)節(jié)性T細(xì)胞　； 參考：《山東大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：研究背景miRNA是一種長(zhǎng)約22nt的非編碼小RNA分子,在幾乎所有生命活動(dòng)和疾病的發(fā)生發(fā)展中都發(fā)揮關(guān)鍵作用。Graves病(GD)是一種最常見(jiàn)的自身免疫性疾病,而調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg)是免疫調(diào)控中的關(guān)鍵細(xì)胞。已有研究表明microRNA對(duì)自身免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展有提示作用,但是microRNA在Graves病中的研究還很少,在Graves病患者外周血Treg細(xì)胞中的研究更少。另外,在研究microRNA的眾多方法中,熒光標(biāo)記和脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染是最常用的兩種方法.這兩種方法結(jié)合可以方便的改變細(xì)胞miRNA水平,并示蹤定位miRNA在細(xì)胞內(nèi)的位置,在miRNA的研究中發(fā)揮重要作用。然而,盡管已有大量脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染核酸機(jī)制的研究,但迄今為止對(duì)熒光素標(biāo)記的miRNA分子在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染過(guò)程中的特點(diǎn)、機(jī)制和特異性的研究仍然不多。研究目的研究microRNA在初發(fā)Graves病Treg中的差異表達(dá)情況及作用,并探討microRNA在外周血Treg中研究較少的原因,以及針對(duì)其中熒光標(biāo)記的microRNA非特異性粘附在細(xì)胞膜表面的現(xiàn)象進(jìn)行深入研究。研究材料和方法我們收集45例初發(fā)Graves病患者和61例正常人外周血,用流式細(xì)胞儀分離出CD4+CD25highTreg細(xì)胞,比較Treg細(xì)胞比例和數(shù)目變化情況；再利用實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)方法從CD4+CD25highTreg細(xì)胞中篩選出表達(dá)有差異的microRNA;最后從差異表達(dá)的microRNAs中選出一個(gè)研究其在正常Treg中的功能。另外,對(duì)于在研究過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的Cy5熒光標(biāo)記的microRNA在轉(zhuǎn)染過(guò)程中與細(xì)胞的非特異性結(jié)合這一現(xiàn)象,進(jìn)一步利用不同熒光素(親水性的羧基熒光素FAM和疏水性的碳烯花菁類Cy5)標(biāo)記的不同microRNA用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染不同細(xì)胞(懸浮細(xì)胞K562和貼壁細(xì)胞Hela),并用流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡等技術(shù)深入研究了在脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染中這種熒光標(biāo)記miRNA與細(xì)胞之間非特異性粘附的普遍性及其可能機(jī)制。研究結(jié)果初發(fā)Graves病患者外周血CD4+CD25highTreg細(xì)胞占CD4+T細(xì)胞的比例和數(shù)目與正常人相比,沒(méi)有明顯差異。而且,單位體積外周血中CD4+CD25highTreg細(xì)胞含量很少。但是,PCR發(fā)現(xiàn),與正常組相比,miR28、miR363和miRl91在初發(fā)Graves病患者外周血CD4+CD25highTreg中表達(dá)有差異,miR28和miR363高表達(dá),miR191低表達(dá)。一些在CD4+CD25highTreg中含量很低的microRNA如miR190、miR519e、miR374a等檢測(cè)不出。流式細(xì)胞儀和共聚焦顯微鏡檢測(cè)顯示Cy5熒光標(biāo)記的microRNA在利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染CD4+T細(xì)胞過(guò)程中存在非常明顯的非特異性粘附。非特異性粘附研究結(jié)果表明,在未加入脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑的情況下,碳烯花菁類熒光染料Cy5標(biāo)記的miRNA分子能與貼壁的Hela細(xì)胞和懸浮的K562細(xì)胞表面牢固結(jié)合；而羧基熒光染料FAM與K562細(xì)胞表面的結(jié)合也非常明顯,但與Hela細(xì)胞表面的結(jié)合不明顯。加入轉(zhuǎn)染試劑后,由于貼壁細(xì)胞轉(zhuǎn)染效率較高,與細(xì)胞表面結(jié)合的大部分熒光標(biāo)記miRNA分子都進(jìn)入貼壁的Hela細(xì)胞內(nèi)；而絕大部分熒光標(biāo)記miRNA分子仍與懸浮的K562細(xì)胞表面結(jié)合,未進(jìn)入細(xì)胞。而且,破壞靜電相互作用的高鹽buffer不影響上述熒光標(biāo)記miRNA分子與不同細(xì)胞表面的非特異結(jié)合,但破壞疏水相互作用的有機(jī)溶劑可以消除它。這提示熒光標(biāo)記的miRNA可能是通過(guò)疏水相互作用而與細(xì)胞表面非特異結(jié)合。研究結(jié)論這些結(jié)果提示,初發(fā)Graves病患者外周血CD4+CD25highTreg比例和數(shù)目沒(méi)有變化,但是Treg中存在部分microRNA差異表達(dá)現(xiàn)象,這些microRNA可能與Graves病患者體內(nèi)免疫失調(diào)有關(guān)。但是,外周血Treg細(xì)胞含量少,而且由于其本身原代懸浮的特性,使microRNA在Treg細(xì)胞中的功能研究受到技術(shù)限制。其中作為研究microRNA在細(xì)胞內(nèi)到底發(fā)揮何種作用時(shí)常用的熒光標(biāo)記microRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞的技術(shù)存在熒光染料與細(xì)胞膜之間發(fā)生非特異性粘附。非特異性粘附機(jī)制研究結(jié)果表明,轉(zhuǎn)染碳烯花菁類熒光染料標(biāo)記的miRNA分子,特別是轉(zhuǎn)染這些分子到懸浮細(xì)胞時(shí),僅根據(jù)細(xì)胞熒光強(qiáng)度評(píng)估轉(zhuǎn)染效率會(huì)導(dǎo)致明顯的誤差。應(yīng)當(dāng)選擇其它熒光染料或其它方法評(píng)價(jià)轉(zhuǎn)染效率。而且,也需要根據(jù)研究所用的細(xì)胞類型選擇更適當(dāng)?shù)臒晒馊玖?并設(shè)置嚴(yán)格的對(duì)照組,以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。
[Abstract]:The research background miRNA is a non - coding small RNA molecule with a length of about 22nt , plays a key role in the development of almost all living activities and diseases . Graves disease ( GD ) is the most common autoimmune disease , and the regulatory T cell ( Treg ) plays an important role in the development of autoimmune diseases .
The expression of CD4 + CD25highTreg cells in peripheral blood of Graves disease was detected by flow cytometry and confocal microscopy .
However , the binding of the carboxy fluorochrome to the surface of K562 cells is very obvious , but the binding of the surface of Hela cells is not obvious . After the transfection reagent is added , most of the fluorescent labeled miRNA molecules bound to the cell surface enter the Hela cells of the adherent cells due to the high transfection efficiency of the adherent cells ;
It is suggested that the fluorescent labeled miRNA may be a non - specific binding to the cell surface by hydrophobic interaction . The results suggest that the fluorescent labeled miRNA may be related to the immune disorder in the cell surface by hydrophobic interaction . The results suggest that the fluorescent label miRNA may be a non - specific adhesion to the cell surface by hydrophobic interaction .
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R581

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 陳勇;劉巍;;microRNA影響抗腫瘤藥物敏感性相關(guān)研究進(jìn)展[J];臨床腫瘤學(xué)雜志;2009年09期

2 牛曉曉;王秦秦;;microRNA與肺癌[J];中國(guó)肺癌雜志;2010年04期

3 劉靜;王小中;;慢性粒細(xì)胞白血病相關(guān)microRNA的研究進(jìn)展[J];分子診斷與治療雜志;2010年04期

4 LEE Younghee;LUSSIER Yves A;;Identification of common microRNA-mRNA regulatory biomodules in human epithelial cancer[J];Chinese Science Bulletin;2010年31期

5 唐志強(qiáng);;The effect of microRNA-21-siRNA-lentivirus on biological behaviors in human hepatic cancer cell line hepG2[J];China Medical Abstracts(Surgery);2012年01期

6 ;PTEN and PDCD4 are Bona Fide Targets of microRNA-21 in Human Cholangiocarcinoma[J];Chinese Medical Sciences Journal;2012年02期

7 林建宇;朱雨捷;王晶;湯溢飛;徐中華;;急性冠狀動(dòng)脈綜合征相關(guān)microRNA靶向通路及其功能分析[J];蘇州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2012年04期

8 崔洪亮;張陽(yáng)德;;microRNA的協(xié)同調(diào)控網(wǎng)的構(gòu)建與研究[J];中國(guó)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志;2012年33期

9 張明杰;徐卓明;朱麗敏;龔霄雷;黃蕊;;先天性心臟病重度肺動(dòng)脈高壓血漿 microRNA 的分析與驗(yàn)證[J];上海醫(yī)學(xué);2013年12期

10 孟勝喜;胡義揚(yáng);馮琴;;microRNA在中醫(yī)藥防治非酒精性脂肪性肝病中的應(yīng)用[J];中華中醫(yī)藥雜志;2014年03期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 荊清;袁文俊;秦永文;;microRNA的基因調(diào)控新功能[A];中國(guó)生理學(xué)會(huì)第五屆全國(guó)心血管、呼吸和腎臟生理學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要匯編[C];2005年

2 靳新;駱志剛;王金華;管乃洋;;microRNA靶標(biāo)研究進(jìn)展[A];中國(guó)遺傳學(xué)會(huì)功能基因組學(xué)研討會(huì)論文集[C];2006年

3 ;Comparasion of Inhibitory Effects on Survivin Gene Expression in Prostate Cancer by Vector-based microRNA and siRNA[A];2008年全國(guó)生物化學(xué)與分子生物學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文摘要[C];2008年

4 朱丹霞;徐衛(wèi);繆扣榮;方成;朱華淵;董華潔;王冬梅;范磊;喬純;李建勇;;慢性淋巴細(xì)胞白血病microRNA異常表達(dá)研究[A];第13屆全國(guó)實(shí)驗(yàn)血液學(xué)會(huì)議論文摘要[C];2011年

5 Yangchao Chen;;Small molecule modulators of microRNA-34a with anti-cancer activities[A];2013醫(yī)學(xué)前沿論壇暨第十三屆全國(guó)腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會(huì)議論文集[C];2013年

6 金希;厲有名;;單純性脂變與非酒精性脂肪性肝炎間差異microRNA表達(dá)譜研究[A];2009香港-北京-杭州內(nèi)科論壇暨2009年浙江省內(nèi)科學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2009年

7 賈新正;盧肖男;聶慶華;張細(xì)權(quán);;雞部分microRNA的同源預(yù)測(cè)與克隆驗(yàn)證[A];中國(guó)動(dòng)物遺傳育種研究進(jìn)展——第十五次全國(guó)動(dòng)物遺傳育種學(xué)術(shù)討論會(huì)論文集[C];2009年

8 李炯;段德民;鄭克孝;;新型非標(biāo)記高通量microRNA芯片技術(shù)[A];第一屆全國(guó)生物物理化學(xué)會(huì)議暨生物物理化學(xué)發(fā)展戰(zhàn)略研討會(huì)論文摘要集[C];2010年

9 徐小濤;陸曉;孫婧;束永前;;肺癌側(cè)群細(xì)胞microRNA表達(dá)譜檢測(cè)及初步分析[A];2010’全國(guó)腫瘤分子標(biāo)志及應(yīng)用學(xué)術(shù)研討會(huì)暨第五屆中國(guó)中青年腫瘤專家論壇論文匯編[C];2010年

10 王俊峰;李巍;吳小江;阮康成;;大鼠附睪microRNA表達(dá)譜的研究[A];第十一次中國(guó)生物物理學(xué)術(shù)大會(huì)暨第九屆全國(guó)會(huì)員代表大會(huì)摘要集[C];2009年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前2條

1 陳英云 喬蕤琳;哈醫(yī)大成功研發(fā)國(guó)內(nèi)首例microRNA轉(zhuǎn)基因及敲減小鼠模型[N];黑龍江經(jīng)濟(jì)報(bào);2010年

2 記者 陳青;2厘米以下肝癌檢出率88%[N];文匯報(bào);2011年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 崔洪亮;microRNA的腫瘤表達(dá)研究及協(xié)同調(diào)控網(wǎng)絡(luò)分析[D];中南大學(xué);2014年

2 馬建華;高粱低磷低氮形態(tài)生理特征及低氮響應(yīng)的microRNA研究[D];山西農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

3 李虔楨;microRNA相關(guān)基因遺傳多態(tài)性與冠心病臨床關(guān)聯(lián)及預(yù)后研究[D];福建醫(yī)科大學(xué);2015年

4 王耀輝;血清microRNA作為乳腺癌診斷標(biāo)志物的研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

5 周霽子;環(huán)境因素對(duì)心臟畸形胎兒影響的表觀遣傳學(xué)機(jī)制[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

6 張麗;microRNA通過(guò)調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞炎性反應(yīng)參與血管性認(rèn)知障礙發(fā)生發(fā)展[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

7 查若鵬;肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)microRNA的鑒定及其分子機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

8 方硯田;結(jié)腸癌干細(xì)胞分選、差異microRNA表達(dá)譜檢測(cè)以及miR-449b-CCND1、E2F3通路在結(jié)腸癌干細(xì)胞自我更新的機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

9 辛成齊;椰棗microRNA鑒定及其在果實(shí)發(fā)育過(guò)程中的表達(dá)譜研究[D];中國(guó)科學(xué)院北京基因組研究所;2015年

10 李棟;先天性心臟病血漿microRNA表達(dá)譜及與GATA4靶序列單核苷酸多態(tài)性的關(guān)聯(lián)研究[D];山東大學(xué);2015年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 高智紅;應(yīng)用多樣性增量方法識(shí)別人類基因組microRNA前體序列[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2010年

2 王娜娜;microRNA進(jìn)化關(guān)系及編碼特性研究[D];內(nèi)蒙古大學(xué);2007年

3 王玫;小麥microRNA的鑒定與分析[D];南昌大學(xué);2007年

4 秦保東;原發(fā)性膽汁性肝硬化microRNA表達(dá)譜的檢測(cè)及其功能研究[D];第二軍醫(yī)大學(xué);2013年

5 徐嬌陽(yáng);循環(huán)microRNA用于低氧性肺動(dòng)脈高壓早期診斷的實(shí)驗(yàn)研究[D];石河子大學(xué);2015年

6 余綺荷;晚期結(jié)直腸癌一線化療的臨床療效預(yù)后分析及療效相關(guān)microRNA的初步篩選[D];復(fù)旦大學(xué);2014年

7 蔡雨函;乙型腦炎病毒的分離鑒定及其在microRNA水平上與PK-15細(xì)胞的相互作用研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

8 葉泥;山羊地方性鼻內(nèi)腺瘤microRNA的表達(dá)差異研究[D];四川農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

9 李敏;活血化痰安神方對(duì)冠心病心絞痛痰瘀互結(jié)證患者臨床及microRNA研究[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2016年

10 程冉;桂枝茯苓丸加味治療子宮肌瘤的療效觀察及對(duì)血清microRNA表達(dá)譜的影響[D];北京中醫(yī)藥大學(xué);2016年

，

本文編號(hào)：1899025