本文選題：腎小球系膜細胞 + 糖尿病腎病��； 參考：《南京醫(yī)科大學》2015年碩士論文

【摘要】：目的探討過表達沉默信息調節(jié)因子1(silent information regulator 1,Sirt1)對高糖誘導的人腎小球系膜細胞(Human glomerular mesangial cell,HMC)增殖與轉化生長因子-β1(TGF-β1)表達的影響,并進一步探究Sirt1對高糖誘導效應影響的可能機制。方法(1)體外培養(yǎng)人腎小球系膜細胞(HMCs),利用Sirt1、Sirt1干擾(Sirt1-RNAi)或相應對照重組慢病毒載體感染細胞獲得過表達Sirt1蛋白或knock down Sirt1的人腎小球系膜細胞;(2)慢病毒感染的HMCs分為8組:(1)正糖+空載慢病毒感染組(NG+LV-CTL),(2)高糖+空載慢病毒感染組(HG+LV-CTL),(3)正糖+Sirt1慢病毒感染組(NG+LV-Sirt1)(4)高糖+Sirt1慢病毒感染組(HG+LV-Sirt1)(5)正糖+無義RNAi病毒感染組(NG+LV-CTL-RNAi),(6)高糖+無義RNAi病毒感染組(HG+LV-CTL-RNAi)(7)正糖+Sirt1-RNAi病毒感染組(NG+LV-Sirt1-RNAi)(8)高糖+Sirt1-RNAi病毒感染組(HG+LV-Sirt1-RNAi);再設立3組未感染細胞作為對照,分別為(1)正常對照組(NG,葡萄糖5.5 mmol/L)、(2)正糖+甘露醇組(NM,5.5mmol/L葡萄糖+24.5mmol/L甘露醇),(3)高糖處理組(HG,葡萄糖濃度30 mmol/L),培養(yǎng)不同時間后以CCK-8法檢測細胞增殖情況;實時定量PCR法檢測TGF-β1的mRNA水平,Western blot法檢測各處理組細胞TGF-β1蛋白表達水平;(3)低糖、高糖處理HMC細胞不同時間后,通過Western blot或免疫共沉淀+Western blot檢測STAT1、STAT3磷酸化、乙酰化水平;(4)通過Western blot或免疫共沉淀+Western blot檢測正糖、高糖處理24小時后的LV-CTL、LV-Sirt1、LV-Sirt1-RNAi組STAT1磷酸化、乙�；�;(5)免疫共沉淀檢測內源性Sirt1與STAT1相互結合作用。結果(1)通過重組慢病毒感染,嘌呤霉素篩選,獲取穩(wěn)定過表達Sirt1和Sirt1干擾的人腎小球系膜細胞系;(2)與NG組相比較,各時間點HG、HG+LV-CTL、HG+LV-Sirt1、HG+LV CTL-RNAi、HG+LV-Sirt1-RNAi組CCK8的OD檢測值均明顯升高(P均0.05)。HG處理24h、48h后,HG+LV-Sirt1組的OD值明顯低于HG、HG+LV-CTL組,HG+LV-Sirt1-RNAi組的OD值明顯高于HG、HG+LV-CTL組;與NG組相比較,HG、HG+LV-CTL、HG+LV-Sirt1組TGF-β1mRNA以及蛋白水平明顯上調,差異均有顯著性(P均0.05);HG+LV-Sirt1組TGF-β1 mRNA以及蛋白水平明顯低于HG、HG+LV-CTL組,而LV-Sirt1-RNAi組的TGF-β1 mRNA以及蛋白水平明顯高于HG、HG+LV-CTL-RNAi組(P均0.05);NG、NM、NG+LV-CTL及NG+LV-Sirt1、NG+LV-CTL-RNAi組間相比較,無統(tǒng)計學差異;(3)高糖以時間依賴性的方式增加STAT1及STAT3磷酸化、乙�；�;(4)與NG+LV-CTL組相比,HG+LV-CTL組、HG+LV-Sirt1-RNAi組的STAT1磷酸化、乙酰化水平均升高,與HG+LV-CTL組相比較,HG+LV-Sirt1組STAT1乙�；较陆�,HG+LV-Sirt1-RNAi組STAT1乙酰化水平升高(P均0.05),HG+LV-CTL組、HG+LV-Sirt1組和HG+LV-Sirt1-RNAi組的磷酸化水平無明顯差異(P0.05);(5)正向、反向免疫共沉淀均能夠檢測到Sirt1蛋白與STAT1蛋白間的結合。結論過表達Sirt1水平能夠抑制高糖誘導的人腎小球系膜細胞增殖、TGF-β1表達以及STAT1、STAT3的乙酰化水平,相反,沉默Sirt1的表達增強了高糖的處理效應;Sirt1可能是通過去乙�；疭TAT1而發(fā)揮其拮抗高糖誘導效應的作用;Sirt1可能成為防治糖尿病腎病的作用靶點。
[Abstract]:Objective to investigate the effect of silent information regulator 1 (Sirt1) on the proliferation of human glomerular mesangial cells (Human glomerular mesangial cell, HMC) and the expression of transforming growth factor - beta 1 (TGF- beta 1) induced by high glucose, and to further explore the possible mechanism of Sirt1 on the effect of high glucose induction. Method (1) Cultured human glomerular mesangial cells (HMCs), using Sirt1, Sirt1 interference (Sirt1-RNAi) or corresponding recombinant lentivirus vector infected cells to obtain human glomerular mesangial cells expressing Sirt1 protein or knock down Sirt1; (2) the HMCs of lentivirus infection is divided into 8 groups: (1) positive sugar + nodTo lentivirus infection group (NG+LV-CTL), (2) high sugar + empty load. Virus infection group (HG+LV-CTL), (3) positive sugar +Sirt1 lentivirus infection group (NG+LV-Sirt1) (4) high sugar +Sirt1 lentivirus infection group (HG+LV-Sirt1) (5) positive sugar + non sense RNAi virus infection group (NG+LV-CTL-RNAi), (6) high sugar + non sense RNAi virus infection group (HG+ LV-CTL-RNAi) (7) positive sugar +Sirt1-RNAi virus infection group (NG+LV-Sirt1-RNAi) (8) high sugar sickness disease The virus infection group (HG+LV-Sirt1-RNAi); 3 groups of uninfected cells were set up as control, respectively (1) normal control group (NG, glucose 5.5 mmol/L), (2) positive sugar + mannitol group (NM, 5.5mmol/L glucose +24.5mmol/L mannitol), (3) high sugar treatment group (HG, glucose 30 mmol/L), and the cell proliferation was detected by CCK-8 method after different time; The mRNA level of TGF- beta 1 was detected by quantitative PCR, and TGF- beta 1 protein expression level was detected by Western blot method. (3) low sugar and high sugar treated HMC cells at different time, STAT1, phosphorylation and acetylation level were detected by Western blot or immunoprecipitation +Western blot; (4) LV-CTL, LV-Sirt1, LV-Sirt1-RNAi group, STAT1 phosphorylation and acetylation level after 24 hours of high glucose treatment; (5) immunoprecipitation was used to detect the interaction of endogenous Sirt1 and STAT1. Results (1) human glomerular mesangial cell lines were obtained by recombinant lentivirus infection, purinomycin screening, and the interference of Sirt1 and Sirt1 were obtained; (2) Compared with the NG group, the OD detection value of each time point HG, HG+LV-CTL, HG+LV-Sirt1, HG+LV CTL-RNAi, HG+LV-Sirt1-RNAi group CCK8 increased obviously (P 0.05).HG processing 24h. The levels of TGF- beta 1mRNA and protein were significantly up-regulated in group HG+LV-Sirt1 (P 0.05), and TGF- beta 1 mRNA and protein levels in group HG+LV-Sirt1 were significantly lower than that of HG, HG+LV-CTL, and TGF- beta 1 mRNA and protein levels in group LV-Sirt1-RNAi. There was no statistical difference. (3) high sugar increased STAT1 and STAT3 phosphorylation and acetylation level in a time dependent manner; (4) the level of STAT1 phosphorylation and acetylation of HG+LV-Sirt1-RNAi group increased in comparison with the NG+LV-CTL group, and the level of STAT1 acetylation in HG+LV-Sirt1 group decreased and HG+LV-Sirt1-RNAi group STAT1 compared with the HG+LV-CTL group. The level of acetylation increased (P 0.05), HG+LV-CTL group, HG+LV-Sirt1 group and HG+LV-Sirt1-RNAi group had no significant difference (P0.05). (5) positive, reverse immunoprecipitation can detect the combination of Sirt1 protein and STAT1 protein. Conclusion over expression of Sirt1 level can inhibit the proliferation of human glomerular mesangial cells induced by high glucose, TGF- beta 1 as well as the level of acetylation of STAT1 and STAT3, on the contrary, the expression of silent Sirt1 enhanced the treatment effect of high glucose; Sirt1 may play its role in antagonizing high glucose induced effect by deacetylation of STAT1; Sirt1 may be the target for the prevention and control of diabetic nephropathy.

【學位授予單位】：南京醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2;R692.9

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本文編號：1884084