本文選題：凝血因子FⅫ + 基因突變��； 參考：《上海交通大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：本研究收集了5個(gè)遺傳性凝血因子Ⅻ(coagulation factor Ⅻ,FⅫ)缺陷癥家系,并對此開展了臨床表現(xiàn)、家系調(diào)查、實(shí)驗(yàn)室檢測和基因診斷等方面的研究;對所發(fā)現(xiàn)的3個(gè)導(dǎo)致CRM-遺傳性FⅫ缺陷癥的突變位點(diǎn)(c.776GA,c.799CG,c.1561GA)進(jìn)行了突變蛋白的結(jié)構(gòu)與功能研究,以探討三個(gè)突變導(dǎo)致遺傳性FⅫ缺陷癥的分子機(jī)制。此外,本研究探討了血小板膜蛋白GPIbβ胞內(nèi)段調(diào)控GPIbα酶切的分子機(jī)制,并應(yīng)用全外顯子測序方法對一例難治性ITP進(jìn)行了基因診斷研究。FⅫ是內(nèi)源凝血系統(tǒng)的啟動(dòng)因子,遺傳性FⅫ缺陷癥是由編碼FⅫ蛋白的基因F12突變所引起的,是一種常染色體隱性遺傳性疾病,患者無臨床出血表現(xiàn),多在術(shù)前凝血篩查中因APTT延長而發(fā)現(xiàn)。本研究對發(fā)現(xiàn)的5個(gè)遺傳性FⅫ缺陷癥進(jìn)行了基因診斷和分子機(jī)制研究。5個(gè)先證者FⅫ活性(FⅫ:C)和抗原(FⅫ:Ag)均明顯降低,基因診斷發(fā)現(xiàn)了F12基因上存在3種基因突變,分別是c.776GA(p.G259E)、c.799CG(p.R267G)和c.1561GA(p.E521K),其中c.776GA(p.G259E)、c.799CG(p.R267G)為國際首次報(bào)道。針對發(fā)現(xiàn)的基因突變,構(gòu)建FⅫ突變表達(dá)質(zhì)粒,在體外探討三個(gè)突變導(dǎo)致遺傳性FⅫ缺陷癥的分子機(jī)制。轉(zhuǎn)染突變質(zhì)粒細(xì)胞內(nèi)外的FⅫ:Ag均明顯下降,細(xì)胞上清中FⅫ:C也明顯下降,提示三種突變是導(dǎo)致FⅫ缺陷的原因;Real time PCR結(jié)果顯示三個(gè)FⅫ突變體均能正常轉(zhuǎn)錄;進(jìn)一步蛋白降解抑制實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示三個(gè)FⅫ突變體通過蛋白酶體進(jìn)行降解是導(dǎo)致FⅫ表達(dá)量下降的根本原因;FⅫ突變體和野生型共轉(zhuǎn)染HEK 293T細(xì)胞結(jié)果顯示FⅫR267G和FⅫG259E具有dominant negative effect,然而,這種dominant negative effect的產(chǎn)生并不是由于FⅫ突變體和野生型形成雜合二聚體而引起的。GPIb-IX-V復(fù)合物是引起血小板活化第一步的受體蛋白,在生理止血中起著重要作用。GPIbα是GPIb-IX-V復(fù)合物中最重要的一個(gè)亞基,其酶切在血栓形成過程中起著負(fù)調(diào)控的作用,對于血小板保存及清除也至關(guān)重要。目前對于GPIb-IX-V復(fù)合物中GPIbα酶切調(diào)控機(jī)制仍不明確。我們前期研究發(fā)現(xiàn)的GPIbβ胞內(nèi)近膜端可以通過與某個(gè)未知蛋白相互作用抑制GPIbα酶切。為明確這個(gè)未知蛋白,我們在大腸桿菌中表達(dá)并提純野生型以及關(guān)鍵部位突變(R151E/R152E或R149E/L150E)的GPIbβ胞內(nèi)段蛋白,利用pull-down結(jié)合蛋白質(zhì)譜(MS)的方法,篩選出多種可能與GPIbβ胞內(nèi)段相互作用的蛋白,包括膜突蛋白(moesin)、血小板反應(yīng)蛋白(thrombospondin)等。免疫性血小板減少性紫癜(immune thrombocytopenia purpura,ITP)是一種獲得性的自身抗體介導(dǎo)的破壞和損害血小板及其再生的血液系統(tǒng)疾病。臨床以皮膚粘膜或內(nèi)臟出血為主要表現(xiàn)。本研究中我們發(fā)現(xiàn)一例激素治療無效的難治性ITP患者,為明確其致病因素,我們對患者外周血DNA/骨髓DNA進(jìn)行了全外顯子組測序,尋找僅存在于骨髓DNA而外周血DNA中為陰性的變異。經(jīng)過生物信息學(xué)分析篩選出一組候選致病基因,進(jìn)一步對其進(jìn)行Sanger測序驗(yàn)證后,最終推斷Ct BP2基因存在p.S240SF突變,從而導(dǎo)致巨核細(xì)胞成熟障礙可能是該患者血小板減少的致病原因。
[Abstract]:This study collected 5 hereditary coagulation factor (coagulation factor F) defect families, and carried out a study of clinical manifestations, family survey, laboratory testing and gene diagnosis, and the mutation protein (c.776GA, c.799CG, c.1561GA), which were found to lead to the CRM- hereditary F deficiency syndrome (c.776GA, c.799CG, c.1561GA), was carried out. The structural and functional studies were conducted to investigate the molecular mechanism of the genetic F deficiency caused by three mutations. In addition, the molecular mechanism of the GPIb beta cell segment of the platelet membrane protein in the regulation of GPIb alpha enzyme digestion was discussed, and an exon sequencing method was used for the diagnosis of a refractory ITP based on the study of the initiation of the endogenous coagulation system. Factor, hereditary F deficiency syndrome is caused by the mutation of the gene F12 that encodes the protein F protein. It is an autosomal recessive hereditary disease. The patient has no clinical bleeding and is found in the preoperation coagulation screening because of the extension of APTT. The genetic diagnosis and molecular mechanism of the 5 hereditary F defects found in this study are.5. The F activation (F) activity (C) and the antigen (F: Ag) were significantly reduced. The gene diagnosis found that there were 3 gene mutations in the F12 gene, c.776GA (p.G259E), c.799CG (p.R267G) and c.1561GA (p.E521K). The molecular mechanism of hereditary F defects caused by three mutations was investigated in vitro. The F of transfected plasmids, both inside and outside the cells of the mutant plasmid, decreased obviously, and the F of the cell supernatant decreased obviously, and C showed that the three mutations were the cause of the defect of F; the Real time PCR results showed that all of the three F mutants could be transcribed normally; further protein degradation and inhibition were suppressed. The results of the experiment showed that the degradation of the three F mutants through proteasome was the root cause of the decrease in the expression of F. The results of the F mutant and the wild type CO transfected HEK 293T cells showed that F R267G and F G259E had dominant negative effect. The.GPIb-IX-V complex, which is caused by the formation of heterozygous two polymer, is a receptor protein that causes the first step of platelet activation. It plays an important role in the physiological hemostasis..GPIb A is the most important subunit in the GPIb-IX-V complex. Its enzyme digestion plays a negative regulatory role in the process of thrombus formation and the preservation and removal of platelets. The regulatory mechanism of GPIb alpha enzyme in the GPIb-IX-V complex is still not clear. Our previous study found that the near membrane end of the intracellular GPIb beta can inhibit the GPIb alpha enzyme digestion by interacting with an unknown protein. To clarify this unknown protein, we express and purify wild type and key site mutations in Escherichia coli (R15). 1E/R152E or R149E/L150E) GPIb beta cytosolic protein, using pull-down binding protein mass spectrometry (MS), to screen out a variety of proteins that may interact with the intracellular segment of GPIb beta, including membrane protein (moesin), platelet reactive protein (thrombospondin), and immune thrombocytopenic purpura (immune thrombocytopenia purpura, ITP). An acquired autoantibody mediated destruction and damage to the blood system disease of platelets and their regeneration. Clinical manifestations of skin and mucous membrane or visceral hemorrhage are the main manifestations. In this study, we found a case of intractable ITP patients with ineffective hormone therapy. In order to identify the pathogeny of the patients, we were fully exoticing the DNA/ bone marrow DNA in the peripheral blood of the patients. The subgroup was sequenced to search for a negative mutation in the peripheral blood DNA only in the bone marrow DNA. A group of candidate genes were screened by bioinformatics analysis. After further Sanger sequencing, it was concluded that the Ct BP2 gene had a p.S240SF mutation, resulting in the megakaryocyte maturation disorder that may be the thrombocytopenia of the patient. Cause of disease.

【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R596

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本文編號：1883561