本文選題：格列齊特 + CYP2C9��； 參考：《南昌大學(xué)》2017年碩士論文

【摘要】：背景:格列齊特屬于治療2型糖尿病的磺酰脲類降糖藥物,臨床主要用于治療非胰島素依賴糖尿病。已有大量研究證實磺酰脲類藥物臨床應(yīng)用降血糖作用時存在較大個體差異性,其中基于代謝酶與轉(zhuǎn)運體的基因多態(tài)性是其重要機制之一。本課題旨在研究格列齊特與代謝酶CYP2C9及轉(zhuǎn)運體OATP1B1的基因多態(tài)性之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)機制,為磺酰脲類藥物臨床合理用藥從而實現(xiàn)個體化用藥提供理論基礎(chǔ)和實驗依據(jù)。目的:通過建立穩(wěn)定高表達野生型和突變型CYP2C9重組酶模型以及OATP1B1重組質(zhì)粒模型,系統(tǒng)研究CYP2C9*1、*2和*3對格列齊特代謝的影響,以及OATP1B1*5、*1a、*15-HEK293T對格列齊特轉(zhuǎn)運的影響,深入探討CYP2C9和OATP1B1的遺傳多態(tài)性影響格列齊特臨床療效個體差異的分子學(xué)機制。方法:(1)建立可靠、穩(wěn)定的格列齊特在CYP2C9重組酶中的孵育體系,并建立在該體系中格列齊特的LC-MS定量檢測方法,檢測孵育體系中剩余格列齊特的濃度。(2)系統(tǒng)研究野生型CYP2C9*1、突變型CYP2C9*2和CYP2C9*3重組酶孵育體系中,格列齊特濃度與孵育時間、酶濃度間的相關(guān)性。并通過測定重組酶體系中格列齊特濃度,比較系列格列齊特濃度在CYP2C9野生型與突變體之間的代謝情況,擬合酶動力學(xué)曲線,計算并比較野生型和突變型孵育體系中酶動力學(xué)參數(shù)V_(max)、K_m、Cl_(int)。(3)培養(yǎng)HEK293T細胞,建立該細胞中格列齊特的LC-MS檢測方法,細胞樣品經(jīng)乙酸乙酯萃取后檢測細胞破碎液中的格列齊特。(4)用MTT法檢測格列齊特對HEK293T的細胞毒性,在此基礎(chǔ)上研究OATP1B1*5-HEK293T、OATP1B1*1a-HEK293T及OATP1B1*15-HEK293T細胞中攝取時間、底物濃度對格列齊特攝取過程的影響。通過測定細胞破碎液中格列齊特濃度,比較3種不同基因型質(zhì)粒模型中格列齊特的攝取動力學(xué)參數(shù)V_(max)、K_m、Cl_(int)。(5)統(tǒng)計分析采用SPSS 12.0軟件進行數(shù)據(jù)處理,所有數(shù)據(jù)均以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(Mean±SD)表示,P0.05為具有顯著性差異,P0.01為具有極顯著性差異。結(jié)果:(1)本實驗建立的測定代謝酶孵育體系及HEK293T細胞樣品中格列齊特的LC-MS分析方法專屬性強、精密度高、穩(wěn)定性好,符合生物樣本分析的相關(guān)要求。(2)格列齊特在不同蛋白濃度(0.1,0.2,0.4,0.6,0.8 mg/ml)野生型CYP2C9*1、突變型CYP2C9*2和CYP2C9*3重組酶孵育體系中孵育100 min后,結(jié)果顯示格列齊特在0.2 mg/ml的CYP2C9*1,0.2 mg/ml的CYP2C9*2,0.4mg/ml的CYP2C9*3孵育體系中格列齊特的代謝率達到80%以上。(3)格列齊特在0.2 mg/ml野生型CYP2C9*1、突變型CYP2C9*2和CYP2C9*3重組酶孵育體系中分別孵育0,10,20,40,80,100,120 min后終止反應(yīng),結(jié)果顯示在不同孵育體系中的最佳孵育時間分別為60 min,80 min,100min。(4)格列齊特(1、2.5、5、10、20、40、80μM)在野生型CYP2C9*1重組酶孵育體系中酶促動力學(xué)參數(shù)K_m、V_(max)及CL_(int)值分別為4.97±0.56μM、197.31±3.11 pmol/min/pmol、39.69±2.51μL/min/(mg proteins);在突變型CYP2C9*2酶促動力學(xué)參數(shù)K_m、V_(max)及CL_(int)值分別為5.18±0.21μM、135.35±1.06pmol/min/pmol、26.12±1.89μL/min/(mg proteins),在突變型CYP2C9*3酶促動力學(xué)參數(shù)K_m、V_(max)及CL_(int)值分別為6.57±1.82μM、102.21±4.94 pmol/min/pmol、15.55±1.71μL/min/(mg proteins)。與野生型CYP2C9*1相比,突變型CYP2C9*2、CYP2C9*3酶反應(yīng)體系中的格列齊特K_m值有所增大,但V_(max)及Cl_(int)顯著減小(P0.05或P0.01),提示格列齊特在突變型CYP2C9*2、CYP2C9*3酶反應(yīng)體系中代謝活性比野生型CYP2C9*1明顯降低。(5)OATP1B1*1a-HEK293T、OATP1B1*5-HEK293T及OATP1B1*15-HEK293T細胞生長狀態(tài)良好,形態(tài)大小均一。通過MTT檢測法確定格列齊特在1-80μM濃度范圍內(nèi)對HEK293T細胞毒性影響較小。(6)格列齊特在OATP1B1*5-HEK293T細胞的攝取動力學(xué)參數(shù)K_m、V_(max)及CL_(int)分別為14.69±1.68μM、5.84±0.37 pmol·min~(-1)·mg~(-1)protein、0.39±0.27μL/min/(mg proteins)。在OATP1B1*15-HEK293T細胞的攝取動力學(xué)參數(shù)K_m、V_(max)及CL_(int)分別為9.80±0.35μM、11.02±0.39 pmol·min~(-1)·mg~(-1)protein、1.12±1.89μL/min/(mg proteins);而在OATP1B1*1a-HEK293T細胞攝取的動力學(xué)參數(shù)K_m、V_(max)及CL_(int)分別為8.19±0.86μM、12.97±0.79 pmol·min~(-1)·mg~(-1 )protein、1.58±0.25μL/min/(mg proteins)。與野生型OATP1B1*1a-HEK293T相比,突變型OATP1B1*15-HEK293T細胞中格列齊特攝取的K_m及V_(max)值無明顯變化,但CL_(int)明顯降低(P0.05);突變型OATP1B1*5-HEK293T細胞中格列齊特攝取的K_m值明顯增大(P0.05),但V_(max)、CL_(int)值顯著減少(P0.01)。提示格列齊特在突變型OATP1B1*15-HEK293T、OATP1B1*5-HEK293T細胞中的攝取能力比野生型OATP1B1*1a-HEK293T明顯減弱,在OATP1B1*5-HEK293T細胞中的攝取能力相對更弱。結(jié)論:(1)格列齊特可被野生型CYP2C9*1、突變型CYP2C9*2、突變型CYP2C9*3重組酶代謝,與野生型CYP2C9*1相比,突變型CYP2C9*2、突變型CYP2C9*3重組酶的代謝活性顯著降低。(2)格列齊特可被OATP1B1*5-HEK293T、OATP1B1*15-HEK293T、OATP1B1*1a-HEK293T細胞攝取轉(zhuǎn)運。與野生型OATP1B1*1a-HEK293T相比,格列齊特在突變型OATP1B1*5-HEK293T、OATP1B1*15-HEK293T細胞中的轉(zhuǎn)運能力明顯減弱,其中OATP1B1*5-HEK293T細胞的轉(zhuǎn)運能力相對更弱。
[Abstract]:Objective : To study the effect of Gliclazide in the treatment of non - insulin dependent diabetes mellitus . Results : ( 1 ) The optimal incubation time of Gliclazide was respectively 4.97 鹵 0.56 渭M , 197.31 鹵 3.11 pmol / min / pmol , 39.69 鹵 2.51 渭L / min / ( mg proteins ) . The results showed that the best incubation time in different incubation systems was 6.57 鹵 1.82渭M , 105.35 鹵 4.94 pmol / min / pmol , 15.55 鹵 1 respectively . ( 6 ) The uptake kinetic parameters K _ m , V _ ( max ) and CL _ ( int ) of OATP1B1 * 1a - HCHO cells were 14.69 鹵 1.68渭M , 5.84 鹵 0.37 pmol 路 min ~ ( -1 ) 路 mg ~ ( -1 ) protein , 0.39 鹵 0.27 渭L / min / ( mg proteins ) respectively . Kinetic parameters K _ m , V _ ( max ) and CL _ ( int ) were 9.80 鹵 0.35 渭M , 11.02 鹵 0.39 pmol 路 min ~ ( -1 ) 路 mg ~ ( -1 ) protein and 1.12 鹵 1.89渭L / min / ( mg proteins ) , respectively , while the kinetic parameters K _ m , V _ ( max ) and CL _ ( int ) were 8.19 鹵 0.86 渭M , 12.97 鹵 0.79 pmol 路 min ~ ( -1 ) 路 mg ~ ( -1 ) protein and 1 . 58 鹵 0.25 渭L / min / ( mg proteins ) respectively . Compared with wild type OATP1B1 * 1 , the ability of uptake of gliclazide in the mutant OATP1B1 * 15 - HCHO cell line was significantly lower than that of wild type OATP1B1 * 1 , the mutant type OATP1B1 * 1 * 1 , the mutant type OATP1B1 * .

【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.1

【參考文獻】

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本文編號：1883072