本文選題：系統(tǒng)性紅斑狼瘡 + 糖基化修飾��； 參考：《廣西醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文

【摘要】：第一部分P糖蛋白基因多態(tài)性與廣西地區(qū)系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病風(fēng)險相關(guān)性研究背景和目的P糖蛋白表達與系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)生、發(fā)展及治療等方面有關(guān),MDRl基因是P糖蛋白編碼基因,本部分研究P糖蛋白(P-gp)MDRl基因rs1128503和rs1045642單核苷酸多態(tài)性(SNP)位點在廣西地區(qū)系統(tǒng)性紅斑狼瘡(SLE)患者及健康人群中的基因分布及頻率,探討rs1128503和rs1045642位點基因多態(tài)性與系統(tǒng)性紅斑狼瘡遺傳易感性的關(guān)系,從基因水平為系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病機制及靶向治療等方面研究提供實驗基礎(chǔ),發(fā)掘與糖蛋白相關(guān)的SLE發(fā)病風(fēng)險遺傳標(biāo)記。方法收集來自廣西地區(qū)的283例SLE確診患者為病例組,選取251例健康體檢者作為對照組。采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)檢測MDR1基因rs1128503和rs1045642位點在病例組與對照組的基因分布頻率,用DNA測序法測定對應(yīng)基因序列,以Hardy-Weinberg平衡(HWE)定律檢驗納入病例的群體代表性及可比性。SNP等位基因及基因型的分布差異用χ2檢驗統(tǒng)計,SNP多態(tài)性與SLE發(fā)病風(fēng)險的關(guān)系用logistic回歸方法分析。結(jié)果兩組在性別和年齡構(gòu)成上無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),具有可比性。經(jīng)HWE定律檢驗,兩組基因頻率符合遺傳平衡,具有群體代表性。rs1128503位點基因型分布頻率無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),等位基因分布頻率有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。以對照組為參照,通過logistic回歸分析校正性別及年齡因素,計算SLE組與對照組的比值比(OR)值,結(jié)果顯示：TT較CC基因型(OR=1.77,95%CI=1.08-2.88,P=O.022),T較C等位基因(OR=1.36,95%CI=1.07-1.74,P=0.014),隱性模型(TT vs.CC+C T,OR=1.49,95%CI =1.04-2.14,P=0.029)。通過不同年齡人群分層分析發(fā)現(xiàn),在40歲及以上人群,T較C等位基因(OR=1.41,95%CI=1.01-1.96,P=0.041),TT較CC基因型(OR=1.74,95%CI=1.07-2.79,P=0.021).rs1045642位點基因型及等位基因分布頻率無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05),SLE發(fā)病風(fēng)險相關(guān)性分析無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論P糖蛋白MDR1基因rs1128503位點的T等位基因和純合子突變TT基因型可能與廣西地區(qū)人群系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)病風(fēng)險有正相關(guān)關(guān)系,尤以40歲及以上人群顯著。第二部分系統(tǒng)性紅斑狼瘡不同活動期血清糖蛋白糖譜差異研究及意義分析背景和目的系統(tǒng)性紅斑狼瘡是一類與免疫功能密切相關(guān)的自身免疫病,免疫反應(yīng)的異常涉及系統(tǒng)性紅斑狼瘡發(fā)病、進展、療效及預(yù)后。蛋白質(zhì)糖基化修飾是一種常見的翻譯后修飾,在免疫細(xì)胞粘附、信號傳導(dǎo)、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、受體構(gòu)成、細(xì)胞分化發(fā)育及免疫調(diào)控等方面均有重要作用。本部分研究應(yīng)用凝集素集合芯片技術(shù)對系統(tǒng)性紅斑狼瘡不同活動期患者血清樣本進行分析,旨在研究其糖蛋白糖譜特征性變化,篩選系統(tǒng)性紅斑狼瘡診斷及活動分期相關(guān)特征性糖譜標(biāo)志,為進一步診療研究提供思路及基礎(chǔ)。方法采用凝集素芯片技術(shù)檢測血清低豐度蛋白糖鏈親和信號,主要包含以下步驟：(1)待測樣本預(yù)處理：等體積混合4組(健康對照組、活動期初診組、活動期治療組及非活動期組)患者血清,使用高豐度蛋白去除柱收集血清低豐度蛋白：(2)收集的低豐度蛋白經(jīng)除鹽、測定濃度后置換為標(biāo)記緩沖液；(3)待測蛋白用Lightning-Link法進行生物素標(biāo)記；(4)生物素標(biāo)記待測蛋白與凝集素芯片進行雜交及Cy5熒光標(biāo)記；(5)芯片掃描、數(shù)據(jù)提��；(6)數(shù)據(jù)統(tǒng)計以SPSS 16.0進行,方差齊者用單因素方差分析,以Student-Newman-Keuls(S-N-K)檢驗進行兩兩比較,方差不齊者用秩和檢驗統(tǒng)計。結(jié)果本次研究中,三次重復(fù)實驗芯片數(shù)據(jù)變異系數(shù)基本滿足片內(nèi)小于15%,片間小于20%。4組樣品中共篩選出20種有統(tǒng)計學(xué)差異的凝集素陽性親和信號,分別是AL、HAL、PSA、RCA60、SNA、EEL、LEL、NML VAL、CFL、ConA、JAC、MPL、PCL、PHA-E、MAL-I、HHL、LCA、RCA-I、 STL。其中AAL、HAL、PSA、RCA60及SNA親和信號在SLE活動期初診組較健康對照組顯著減弱(P0.05),提示SLE活動期初診組的血清糖蛋白糖鏈譜中末端巖藻糖、唾液酸化路易斯抗原、N-乙酰半乳糖胺、α連接甘露糖、α.2,6連接唾液酸糖鏈結(jié)構(gòu)表達減少。而經(jīng)治療的活動期治療組和非活動期組與初診組相比,上述5種凝集素親和信號顯著上升(P0.05),提示上述相對應(yīng)的糖鏈結(jié)構(gòu)合成較初診組增加,基本恢復(fù)到健康對照組水平。EEL、LEL及NML凝集素親和信號在活動期初診組較對照組明顯增高(P0.05),提示活動期初診組的血清糖蛋白a1,3連接半乳糖、N-乙酰氨基葡糖、高甘露糖結(jié)構(gòu)顯著增多。而活動期治療組和非活動期組水平與對照組相近,提示經(jīng)治療后對應(yīng)糖鏈結(jié)構(gòu)表達較初診組減低,基本恢復(fù)到或略低于健康對照組水平。VAL、CFL及MPL信號在初診組與對照組無顯著差異,在治療組和非活動期組顯著增高(P0.05)。ConA、JAC、PCL及PHA-E的信號在初診組較對照組顯著升高,在經(jīng)治療后的兩組,上述4種凝集素信號進一步提高(P0.05)。其余5種凝集素STL、MAL-I、HHL、LCA、 RCA-I親和信號在4個實驗組中也有相應(yīng)特征性變化。結(jié)論各種凝集素親和信號變化趨勢各有不同,表示SLE治療過程中不同活動期血清糖蛋白糖鏈結(jié)構(gòu)變化的復(fù)雜性與特異性,這提示以SLE不同活動期血清特征性糖譜作為疾病活動度分期生物標(biāo)志具備一定的實驗基礎(chǔ)。SLE初診期血清糖蛋白結(jié)構(gòu)中末端巖藻糖、唾液酸化路易斯抗原、N-乙酰半乳糖胺、α連接甘露糖及α2,6連接唾液酸結(jié)構(gòu)合成明顯減少,α1,3連接半乳糖、N-乙酰氨基葡糖、高甘露糖結(jié)構(gòu)合成增多,而經(jīng)治療后,這些糖鏈結(jié)構(gòu)的合成逐漸恢復(fù)至接近正常水平。提示這些糖鏈結(jié)構(gòu)表達水平變化可能與SLE發(fā)病機制或疾病活動進展有關(guān)。第三部分系統(tǒng)性紅斑狼瘡不同活動期血清糖蛋白糖譜差異免疫驗證背景和目的凝集素作為糖的“解碼器”在糖組學(xué)和糖蛋白組學(xué)研究中應(yīng)用廣泛。但與抗原抗體反應(yīng)相比,凝集素與糖鏈結(jié)構(gòu)結(jié)合的親和性和特異性仍是其相關(guān)技術(shù)的“瓶頸”。因此,對凝集素芯片的結(jié)果,常需要使用其它實驗方法進行驗證,以提高實驗數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。在本部分研究中,我們以凝集素芯片檢測同批血清樣本及按相同納入標(biāo)準(zhǔn)收集的另批次血清樣本為研究對象,采取凝集素免疫印跡技術(shù)對凝集素芯片結(jié)果進行重復(fù)驗證,以提高芯片結(jié)果的可靠性。方法選取凝集素芯片檢測同批混合血清樣本及按相同納入標(biāo)準(zhǔn)收集的另批次血清樣本為研究對象,實驗步驟主要包括：(1)制備混合血清樣本與富集血清低豐度蛋白,測定蛋白濃度后備用;(2)待測蛋白進行SDS-PAGE電泳后,用半干轉(zhuǎn)膜法將蛋白轉(zhuǎn)至PVDF膜；(3)PVDF膜與生物素標(biāo)記凝集素雜交后,進行辣根過氧化物酶標(biāo)記：(4)利用增強化學(xué)發(fā)光法檢測標(biāo)記凝集素蛋白條帶；(5)結(jié)果掃描及Quantity One軟件分析。結(jié)果以凝集素芯片檢測同批混合血清及另批次血清進行凝集素免疫印跡驗證,選擇SNA、ConA、PHA-E、LCA、PSA及AAL 6種凝集素進行,膜條結(jié)果用Bio-rad公司的Quantity One軟件進行分析,以蛋白條帶灰度值總和代表條帶的強度,即相應(yīng)糖鏈結(jié)構(gòu)的水平。驗證結(jié)果以條帶灰度柱形圖表示,結(jié)果顯示：同批混合血清凝集素驗證結(jié)果變化趨勢基本與凝集素芯片結(jié)果一致；另批次血清凝集素驗證結(jié)果變化趨勢大部分與芯片結(jié)果相符,PHA-E驗證結(jié)果中非活動期組蛋白條帶灰度較弱,與初診組相近,這與芯片結(jié)果比較有偏差。兩批次驗證條帶整體強度與芯片熒光強度結(jié)果有所差異。結(jié)論兩批次血清樣本凝集素免疫印跡驗證結(jié)果大部分與凝集素芯片結(jié)果相一致,可以基本證實本次研究凝集素芯片結(jié)果的準(zhǔn)確性和可重復(fù)性。新批次驗證結(jié)果中PHA-E凝集素組的不一致性可能與個體差異、批間誤差等因素有關(guān)。具體仍有待進一步研究。兩批次驗證結(jié)果都存在印跡條帶強度與芯片熒光強度不完全一致的現(xiàn)象,原因可能由驗證凝集素的稀釋度不同或方法學(xué)差異所致。第四部分靜注唾液酸化免疫球蛋白與系統(tǒng)性紅斑狼瘡治療有效性的循證醫(yī)學(xué)研究背景和目的靜注免疫球蛋白近年來逐漸用以治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡,其機制與IgG分子連接的糖鏈結(jié)構(gòu)α2,6唾液酸有關(guān)。但是,靜注免疫球蛋白對系統(tǒng)性紅斑狼瘡療效的影響在已發(fā)表文獻中報道并非完全一致。因此,我們以臨床隨機研究為對象,采用循證醫(yī)學(xué)研究方法探討糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑聯(lián)合靜脈注射唾液酸化免疫球蛋白治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的效果。方法通過計算機檢索PubMed.EMBASE.Cochrane圖書館等外文數(shù)據(jù)庫以及中國知網(wǎng)、中國生物醫(yī)學(xué)文獻、萬方、維普等中文數(shù)據(jù)庫,查找糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑聯(lián)合靜注唾液酸化免疫球蛋白治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡的隨機對照試驗(文獻發(fā)表于2015年2月10日之前),對入選研究進行篩選、資料提取,臨床緩解率、系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動指數(shù)、補體C3血清學(xué)變化、24小時蛋白尿、院內(nèi)感染率等具體指標(biāo)直接或間接由最終納入文獻提取或計算,并對文獻質(zhì)量按Jadad量表進行評價,提取數(shù)據(jù)使用Stata12.0統(tǒng)計軟件進行薈萃分析。結(jié)果檢索及篩選后共納入5個隨機對照試驗研究,共237例患者,其中試驗組115例,對照組122例。薈萃分析結(jié)果顯示：糖皮質(zhì)激素和免疫抑制劑聯(lián)合靜注唾液酸化免疫球蛋白組與對照組相比,提高SLE患者臨床緩解率(OR=2.99,95%CI=1.53-5.85,P=0.001)和降低院內(nèi)感染率(OR=0.26,95%CI=0.10-0.66,P=0.005)差異有統(tǒng)計學(xué)意義。但對降低狼瘡活動指數(shù)SLEDAI評分(WMD=-1.80,95%CI=-3.96-0.35,P=0.101)和24小時尿蛋白量(WMD=-1.09,95%CI=-2.20-0.03,P=0.056)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)論目前基于臨床隨機研究的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)表明,靜注射唾液酸化免疫球蛋白與激素、免疫抑制劑聯(lián)合治療系統(tǒng)性紅斑狼瘡,對提高臨床緩解率和降低院內(nèi)感染發(fā)生率方面有積極作用,而對SLE活動指數(shù)及24小時尿蛋白量的影響無統(tǒng)計學(xué)差異。這一相關(guān)性有待更多的臨床研究證實,而免疫球蛋白唾液酸糖基化修飾對提高系統(tǒng)性紅斑狼瘡治療有效性的具體機制也有待進一步探索。
[Abstract]:The gene distribution and frequency of rs1128503 and rs1045642 loci in SLE patients and healthy population were analyzed by using PCR - RFLP . It was found that T allele and homozygous mutation TT genotype of P glycoprotein MDR1 gene rs1128503 could be positively correlated with the risk of systemic lupus erythematosus in Guangxi .
( 3 ) the protein to be detected is labeled with a Lightning - Link method ;
( 4 ) biotin labeling the protein to be detected and a lectin chip for hybridization and Cy5 fluorescence labeling ;
( 5 ) chip scanning and data extraction ;
The results showed that there were no significant differences between the two groups in the early diagnosis group than those in the control group ( P0.05 ) . The results showed that the levels of serum glycosilation , sialylated Lewis antigen , N - acetylgalactosamine , 偽 - linked mannose , 偽 . 2,6 - linked sialic acid in the early diagnosis group were significantly higher than those in the control group .
( 3 ) after the PVDF membrane is hybridized with the biotin - labeled lectin , carrying out horseradish peroxidase marking : ( 4 ) detecting the labeled lectin protein band by using the enhanced chemiluminescence method ;
( 5 ) Result scanning and Quantity One software analysis . The results were as follows : lectin chip was used to detect the lectin immunoblot verification in the same batch of mixed serum and another lot of serum . The results were analyzed by using the Quantity One software of Bio - rad . The results show that the results show that the change trend of the results is consistent with the results of lectin chip .
The results of this study are as follows : The results of this study are as follows : The results of this study are as follows : The results of this study are as follows : The results of this study are as follows : The results of this study are consistent with the results of the results .

【學(xué)位授予單位】：廣西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R593.241

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3 鄭嶸君;男性系統(tǒng)性紅斑狼瘡病例分析[D];浙江大學(xué);2009年

4 溫蝶梅;中西醫(yī)結(jié)合治療陰虛內(nèi)熱證系統(tǒng)性紅斑狼瘡的遠(yuǎn)期療效分析[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2010年

5 吳會霞;系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者動脈粥樣硬化的臨床相關(guān)研究[D];暨南大學(xué);2010年

6 郝曉紅;系統(tǒng)性紅斑狼瘡臨床研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2010年

7 孫樂棟;系統(tǒng)性紅斑狼瘡內(nèi)臟損害的臨床研究[D];第一軍醫(yī)大學(xué);2000年

8 劉新霞;系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者血清性激素水平的變化及作用探討[D];暨南大學(xué);2004年

9 樓波;血漿骨橋蛋白檢測與系統(tǒng)性紅斑狼瘡活動性關(guān)系的研究[D];浙江大學(xué);2006年

10 胡以松;系統(tǒng)性紅斑狼瘡分子流行病學(xué)研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2003年

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本文編號：1882149