本文選題：利拉魯肽 + 人臍帶間充質(zhì)干細胞　； 參考：《福建醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：目的:1、體外觀察利拉魯肽(liraglutide,Lira)對人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,h UC-MSCs)增殖、凋亡的作用,并比較其與胰升糖素樣肽-1(glucagon like peptide 1,GLP 1)作用效果的差異。2、體外觀察利拉魯肽對h UC-MSCs增殖、凋亡的作用,并對其與PI3K/Akt通路的關(guān)系進行初步探討。3、采用高糖、尼克酰胺、利拉魯肽三步法誘導(dǎo)h UC-MSCs分化為胰島素分泌細胞(insulin producing cells,IPCs),并觀察利拉魯肽對h UC MSCs分化的影響。方法:1、取h UC-MSCs種植到25cm2培養(yǎng)瓶中,2-3天換一次液,待細胞融合度達到60 70%時,分為三組:正常細胞對照組,未做任何處理;GLP-1組,按濃度梯度1:10比例配制成10-9、10-8、10-7mol/L三種濃度;利拉魯肽組(Lira組),按濃度梯度1:10比例配制成10-9、10-8、10-7mol/L三種濃度;分別加入GLP 1或利拉魯肽培養(yǎng)24h、48h,采用Cell Counting Kit 8(CCK-8)法測定GLP 1和利拉魯肽組h UC-MSCs的增殖能力,Annexin V FITC/PI流式細胞術(shù)檢測GLP 1和利拉魯肽組的凋亡率,并比較利拉魯肽與GLP-1作用效果之間的差異。2、取對數(shù)生長期h UC-MSCs種植到25cm2培養(yǎng)瓶中,待細胞融合達度到60 70%時,分為四組:正常細胞對照組,未做任何處理;利拉魯肽組(Lira組),添加利拉魯肽干預(yù)h UC-MSCs 24h;LY294002組(LY組),添加20μmol/L的PI3K/Akt通路抑制劑LY294002干預(yù)h UC-MSCs 24h;利拉魯肽+LY294002組(Lira+LY組),用20μmol/L LY294002預(yù)處理細胞2h后,添加利拉魯干預(yù)h UC-MSCs 24h。采用ELISA法檢測各組細胞上清液中環(huán)磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate,c AMP)的濃度,Western Blot技術(shù)檢測各組細胞p Akt、Akt蛋白的表達水平。3、采用高糖、尼克酰胺、利拉魯肽三步法誘導(dǎo)P5代h UC-MSCs分化為IPCs。具體方法:先采用含25mmol/L高糖的HG-DEME培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞10天;然后換為加入10mmol/L尼克酰胺的LG-DEME培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞7天;最后用添加10-8mol/L利拉魯肽的LG-DEME培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞7天。倒置顯微鏡下動態(tài)觀察誘導(dǎo)前及分化過程中細胞形態(tài)的變化,采用雙硫腙(dithizone,DTZ)染色法鑒定IPCs,ELISA法測定各誘導(dǎo)階段末細胞上清液中胰島素的濃度及高糖刺激前后細胞上清液中胰島素的濃度,Western Blot法檢測各階段細胞胰腺十二指腸同源盒1(pancreatic duodenal homeobox 1,PDX-1)、Insulin蛋白的表達水平。結(jié)果:1、GLP-1和Lira各濃度組作用細胞24h后,與各自的對照組比較,Lira 10-9mol/L濃度組增殖力增高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);GLP-1和Lira余各濃度組增殖力均增高(P0.05),與各自的對照組比較,GLP-1和Lira各濃度組凋亡率均降低(P0.05)。不同濃度組相互比較,GLP-1各濃度組增殖力相互比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);凋亡率相互比較,與GLP-1 10-9mol/L濃度組凋亡率比較,GLP-110-8mol/L與10-7mol/L濃度組凋亡率均降低(P0.05),與GLP-1 10-8mol/L濃度組凋亡率比較,GLP-1 10-7mol/L濃度組凋亡率降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);Lira各濃度組間增殖力、凋亡率分別相互比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),其中Lira 10-7mol/L濃度組增殖力最高,凋亡率最低。作用細胞48h后,GLP-1和Lira10-9mol/L濃度組增殖力分別與各自的對照組比較,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);與各自的對照組比較,GLP-1 10-8mol/L濃度組增殖力增高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);Lira 10-8mol/L濃度組增殖力增高(P0.05);GLP-1和Lira 10-7mol/L濃度組增殖力均增高(P0.05);GLP-1和Lira各濃度組凋亡率分別與各自的對照組比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);GLP-1各濃度組增殖力相互比較,與GLP-110-9mol/L濃度組比較,GLP-1 10-8mol/L濃度組增殖力增高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);GLP-1 10-7mol/L濃度組增殖力增高(P0.05);與GLP-1 10-8mol/L濃度組比較,GLP-1 10-7mol/L濃度組增殖力增高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);Lira各濃度組間增殖力相互比較,與Lira 10-9mol/L濃度組比較,Lira 10-8mol/L與10-7mol/L濃度組增殖力均增高(P0.05);與Lira 10-8mol/L濃度組比較,Lira10-7mol/L濃度組增殖力增高,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。GLP-1和Lira各濃度組凋亡率分別相互比較,差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。按照細胞活力公式計算Lira各濃度組細胞活力,Lira組同一濃度在不同時間點的增殖活力比較,Lira各濃度組分別作用48h后的增殖活力較作用24h后的增殖活力均降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。2、干預(yù)h UC-MSCs 24h后,與對照組比較,Lira濃度組c AMP的濃度明顯增高(P0.05),LY組c AMP的濃度明顯降低(P0.05),Lira+LY組的濃度降低,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。與Lira組比較,LY組與Lira+LY組c AMP的濃度均明顯降低(P0.05);與LY組比較,Lira+LY組c AMP的濃度明顯增高(P0.05)。Western Blot法結(jié)果顯示:干預(yù)h UC-MSCs 24h后,與對照組比較,Lira組P-AKT蛋白的表達量增加(P0.05),LY組、Lira+LY(12h)組和Lira+LY(24h)組P-AKT蛋白的表達量均降低(P0.05);與LY組比較,Lira+LY(12h)組與Lira+LY(24h)組P-AKT蛋白的表達量均增加(P0.05);與Lira+LY(12h)組比較,Lira+LY(24h)組P-AKT蛋白的表達量降低(P0.05)。3、倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài),誘導(dǎo)前h UC-MSCs為長梭形;一階段誘導(dǎo)后,細胞開始聚集,成“集束狀”排列;二階段誘導(dǎo)后,細胞開始懸浮生長,聚集成團,細胞形態(tài)開始改變,出現(xiàn)圓形細胞;三階段誘導(dǎo)后,細胞團數(shù)量明顯增多。DTZ染色結(jié)果顯示:誘導(dǎo)前及一階段末細胞DTZ染色陰性,二階段末部分細胞團DTZ染色陽性,三階段末,DTZ陽性細胞團數(shù)量明顯增加。ELISA檢測結(jié)果顯示:一階段末,細胞上清液中胰島素的濃度微量,二階段末及三階段末細胞上清液中胰島素濃度逐漸增高。誘導(dǎo)前及一階段誘導(dǎo)后,細胞對高糖刺激無反應(yīng)(P0.05),二階段和三階段誘導(dǎo)后,細胞對高糖刺激反應(yīng)明顯(P0.05)。Western Blot結(jié)果顯示:誘導(dǎo)前PDX-1、Insulin蛋白表達陰性,誘導(dǎo)后PDX-1、Insulin蛋白表達水平逐漸增加。結(jié)論:1、利拉魯肽與GLP-1均可以促進h UC-MSCs增殖、抑制其凋亡,且利拉魯肽的作用效果較好,且可能通過激活PI3K/Akt通路發(fā)揮作用。2、利拉魯肽可以上調(diào)h UC-MSCs內(nèi)c AMP的濃度,并且可以阻斷LY294002對h UC-MSCs分泌c AMP的抑制作用。3、體外采用高糖、尼克酰胺、利拉魯肽三步法可以誘導(dǎo)h UC-MSCs細胞分化為成熟的IPCs。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1

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本文編號：1816605