發(fā)布時間：2018-04-25 01:36

  本文選題：低血糖 + 緊密連接��； 參考：《上海交通大學》2015年碩士論文

【摘要】：低血糖是糖尿病患者采用胰島素強化治療時常見而嚴重的并發(fā)癥。臨床研究表明,低血糖誘發(fā)的腦水腫是低血糖性腦損傷的始動過程。腦微血管內(nèi)皮細胞是血腦屏障重要組成成分,位于相鄰內(nèi)皮細胞間的緊密連接通過限制小分子物質(zhì)通過進而維持腦組織內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定。但是,低血糖是否通過破壞緊密連接來影響腦微血管內(nèi)皮細胞功能引起腦水腫的發(fā)生迄今還沒有被研究。血管內(nèi)皮生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF),作為調(diào)節(jié)血管功能的一個潛在因子,在腦缺血中具有保護作用已經(jīng)被證實,并且還能促進神經(jīng)元的存活及突觸的生長。這些報道促使我們研究VEGF對低血糖性腦內(nèi)皮細胞功能是否具有保護作用。我們采用永生化的小鼠腦微血管內(nèi)皮細胞作為研究對象,體外模擬血腦屏障。首先,研究低糖條件對腦微血管內(nèi)皮細胞的影響。通過采用熒光素鈉(Na-F)檢測暴露于低糖條件的跨內(nèi)皮細胞的通透性;Western blot和細胞免疫熒光(IF)檢測緊密連接相關蛋白claudin-5,ZO-1和occludin的表達變化和分布改變;乳酸脫氫酶實驗(LDH實驗)檢測低糖對內(nèi)皮細胞的毒性作用。結(jié)果顯示,與正常葡萄糖組相比,低糖條件組(0、0.5、1 mM)的跨內(nèi)皮細胞通透性均明顯升高,同時,緊密連接蛋白claudin-5的表達也相應下降。當較長時間(24 h)較低糖濃度(0、0.5 mM)時,腦內(nèi)皮細胞毒性增加。進而,我們采用ELISA檢測低糖條件下24 h后培養(yǎng)基中的VEGF的分泌量,發(fā)現(xiàn)低糖條件組中分泌的VEGF含量比正常葡萄糖條件組中高。最后,通過外加VEGF研究低糖條件下VEGF對腦內(nèi)皮細胞是否有保護作用,我們檢測了低糖和VEGF共存條件下跨內(nèi)皮細胞通透性、緊密連接相關蛋白以及細胞毒性的變化。另外,我們還檢測了轉(zhuǎn)運葡萄糖的主要蛋白Glut-1和反映細胞凋亡程度的主要指標Bcl-2的表達變化。實驗結(jié)果顯示,與低糖組相比,低糖和VEGF共存條件下跨內(nèi)皮細胞通透性降低、claudin-5表達相應增加以及內(nèi)皮細胞的毒性顯著下降。另外,Glut-1和Bcl-2蛋白表達水平比低糖組顯著增加。綜上所述,該研究發(fā)現(xiàn)低糖條件下緊密連接蛋白claudin-5表達下降,跨內(nèi)皮細胞通透性增加,這可能是低血糖引起腦水腫的重要分子機制之一。同時,低糖時VEGF對腦微血管內(nèi)皮細胞可能具有保護作用。
[Abstract]:Hypoglycemia is a common and serious complication of intensive insulin therapy in diabetic patients. Clinical studies have shown that brain edema induced by hypoglycemia is the starting process of hypoglycemic brain damage. The cerebral microvascular endothelial cells are important components of the blood brain barrier, and the close intercellular junction between adjacent endothelial cells is restricted by small molecular substances. Vascular endothelial growth factor (VEGF), as a potential factor in regulating vascular function, is in the brain. The protective effects of ischemia have been confirmed and also promote the survival of neurons and the growth of synapses. These reports have prompted us to study the protective effect of VEGF on hypoglycemic endothelial cell function. We use immortalized mouse brain microvascular endothelial cells as research objects, and in vitro mimic blood brain barrier. The effects of low sugar conditions on cerebral microvascular endothelial cells were investigated. The permeability of cross endothelial cells exposed to low glucose conditions was detected by fluorescein sodium (Na-F); Western blot and cell immunofluorescence (IF) detected the change and distribution of closely linked protein claudin-5, ZO-1 and occludin; lactate dehydrogenase experiment (LDH experiment) The toxicity of low sugar to endothelial cells was detected. The results showed that the permeability of the endothelial cells in the low glucose group (0,0.5,1 mM) increased significantly compared with the normal glucose group, and the expression of the close connexin claudin-5 decreased correspondingly. The toxicity of the endothelial cells increased when a longer time (24 h) was lower (0,0.5 mM). We used ELISA to detect the secretion of VEGF in the medium after 24 h in low sugar conditions and found that the VEGF content in the low sugar group was higher than that in the normal glucose group. Finally, the VEGF was used to study the protective effect of VEGF on the endothelial cells under low sugar conditions. We detected the cross endothelium under the coexistence of low sugar and VEGF. Cell permeability, close connection of related proteins and changes in cytotoxicity. In addition, we also detected the major protein Glut-1 of transshipment of glucose and the changes in the expression of Bcl-2, the main indicator of the degree of apoptosis. Experimental results showed that, compared with the low sugar group, the cross endothelial cell permeability decreased under the coexistence of low sugar and VEGF, and the claudin-5 table In addition, the expression level of Glut-1 and Bcl-2 protein was significantly higher than that in the low sugar group. To sum up, the study found that the expression of compact connexin claudin-5 decreased and the permeability of endothelial cells increased under low sugar conditions, which may be one of the important molecular mechanisms of brain edema caused by hypoglycemia. At the same time, VEGF may protect brain microvascular endothelial cells at low sugar level.

【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R587.2;R743

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本文編號：1799202