本文選題：晚期糖基化終產(chǎn)物 + mDia1��； 參考：《南方醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文

【摘要】：晚期糖基化終產(chǎn)物(advanced glycation end products,AGEs)是蛋白質(zhì)賴氨酸的氨基和還原糖的醛基之間發(fā)生非酶性糖基化反應(yīng),形成Schifi堿,經(jīng)Amadori反應(yīng)并重排后形成相對穩(wěn)定終產(chǎn)物的總稱。AGEs與糖尿病及其并發(fā)癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān),尤其是在血管通透性中起著重要作用,本實(shí)驗(yàn)室前期工作已證實(shí)AGEs通過與其特異性受體RAGE結(jié)合,通過氧化應(yīng)激等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,影響肌動蛋白的組構(gòu)及內(nèi)皮細(xì)胞鈣依賴性粘附蛋白、VE-cadherin結(jié)構(gòu)形態(tài)的改變,引起內(nèi)皮細(xì)胞收縮,導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞通透性增高,從而導(dǎo)致血管通透性增高。Diaphanous相關(guān)成蛋白(Diaphanous—related formins,DRF)族成員因具有兩個特殊的功能結(jié)構(gòu)域,GTP酶結(jié)合結(jié)構(gòu)域(GT—Pase binding domain, GBD)和Diaphanous自調(diào)節(jié)結(jié)構(gòu)域(Diaphanous.autoregulatory domain, DAD)而被劃分為formins家族的一個亞類,廣泛分布于從酵母到哺乳動物等各種真核細(xì)胞中,mmDial是其中的一員,之前研究證明該亞家族對細(xì)胞黏附、運(yùn)動、胞質(zhì)的分裂、形態(tài)的發(fā)生、細(xì)胞極性的形成、血清反應(yīng)因子的激活等起重要調(diào)控作用,而近期有研究顯示,mDial的FH1段可以與RAGE胞漿段結(jié)合,在轉(zhuǎn)化的細(xì)胞株中,RAGE配體介導(dǎo)的細(xì)胞遷移是需要mDial參與的：另外,在配體刺激下,RAGE可通過與mDial相互結(jié)合并引發(fā)氧化應(yīng)激從而參與心血管疾病的發(fā)生發(fā)展。本實(shí)驗(yàn)室前期已證實(shí)的AGEs通過與RAGE結(jié)合,進(jìn)而通過氧化應(yīng)激等信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制影響VE-cadherin結(jié)構(gòu)形態(tài)的的改變,但RAGE與氧化應(yīng)激之間沒有直接作用關(guān)系。據(jù)此我們推測,AGEs通過其配體RAGE結(jié)合激活mDial,并進(jìn)而引發(fā)氧化應(yīng)激導(dǎo)致下游相應(yīng)信號分子活化,最終介導(dǎo)HUVECs通透性增高。研究目的：本研究旨在闡明mDial是否參與AGEs介導(dǎo)的HUVECs通透性增高,并探討其具體機(jī)制。方法：實(shí)驗(yàn)中主要的研究對象為人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)。采用原代分離、細(xì)胞培養(yǎng)、免疫印跡、免疫熒光、流式細(xì)胞術(shù)、siRNA干擾、轉(zhuǎn)染質(zhì)粒、腺病毒、跨內(nèi)皮細(xì)胞電阻測定同時應(yīng)用FITC標(biāo)記的右旋糖酐檢測通透性等方法,觀察AGEs刺激下HUVECs氧化應(yīng)激水平、酪氨酸激酶Src磷酸化水平、內(nèi)皮細(xì)胞鈣依賴性粘附蛋白VE-cadherin磷酸化水平以及VE-cadherin分布變化等情況。AGE修飾的牛血清白蛋白(AGE-modified bovineserum albumin AGEs),由牛血清白蛋白D-葡萄糖共孵育8周制得。原代分離人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞HUVECs并于體外培養(yǎng),接種于3.5cm、6cm、10cm培養(yǎng)皿、微孔小皿(petri dish)、雙層通透的培養(yǎng)皿(transwell)頂層小室微孔膜上(直徑6.5mmm,孔徑大小0.4大小),待細(xì)胞長至融合或接近融合時,換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)2h,使細(xì)胞獲得同步生長,然后按實(shí)驗(yàn)分組分別處理備用。構(gòu)建RAGE野生型及突變質(zhì)粒；選用mDial siRNA以及干擾與過表達(dá)型腺病毒,經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染以及感染HUVECs48h后,繼以AGEs 100mg/L孵育,用流式細(xì)胞儀檢測活性氧產(chǎn)生；蛋白免疫印跡檢測Src與VE-cadherin的磷酸化,采用多功能蛋白組學(xué)影像系統(tǒng)直接成像,以Image J軟件分析各組灰度值,β-actin為內(nèi)參進(jìn)行校正,以對照組面積灰度值為100%與實(shí)驗(yàn)組進(jìn)行比較；用電阻儀測定跨內(nèi)皮細(xì)胞單層電阻(Trans Endothelial Electrical Resistance, TER),并同時用FITC標(biāo)記右旋糖酐漏出法測定單層內(nèi)皮細(xì)胞的通透系數(shù)(Pa,apparent permeability coefficient);用免疫熒光染色法、激光共聚焦顯微鏡觀察內(nèi)皮細(xì)胞VE-cadherin的形態(tài)改變情況。結(jié)果：1.AGEs介導(dǎo)HUVECs通透性增高,mDia1參與其中。(1) AGEs通過其受體RAGE介導(dǎo)HUVECs通透性增高。給予AGEs刺激8h,HUVECs TER顯著下降,與0h相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,同時FITC-dextran漏出顯著增多,與不加刺激組相比,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而預(yù)轉(zhuǎn)染RAGE siRNA和control siRNA 48h后,再給予AGEs 100mg/L刺激8h,用電阻儀檢測TER,同時以FITC-dextran漏出法測Pa。結(jié)果顯示,與予AGEs刺激組相比,預(yù)轉(zhuǎn)染RAGE siRNA組的TER下降幅度明顯降低、FITC-dextran漏出明顯減少,control siRNA則無明顯改變。結(jié)果提示：AGEs通過其受體RAGE導(dǎo)致HUVECs通透性增高。(2) mDia1參與了AGEs介導(dǎo)的HUVECs通透性增高。分別預(yù)轉(zhuǎn)染mDia1 siRNA和control siRNA、感染mDia1干擾型、過表達(dá)型及相應(yīng)對照腺病毒48h后,再給予AGEs100mgL刺激8h,用電阻儀檢測TER,同時以FITC-dextran漏出法測Pa。結(jié)果顯示,與AGEs刺激組相比,預(yù)轉(zhuǎn)染mDia1 siRNA組與感染mDia1干擾型腺病毒組的TER下降幅度明顯降低、FITC-dextran漏出明顯減少,control siRNA及對照腺病毒則無明顯改變：而感染了mDia1過表達(dá)型腺病毒組與.AGEs刺激組相比,TER下降幅度明顯增大、FITC-dextran漏出明顯增多,感染對照腺病毒組則無明顯改變。結(jié)果提示：mDial在AGEs介導(dǎo)的HUVECs通透性增高中起作用,且與該過程正相關(guān)。(3) mDia1通過與RAGE結(jié)合參與AGEs介導(dǎo)的HUVECs通透性增高。構(gòu)建RAGE的野生型及突變型真核表達(dá)質(zhì)粒,突變型質(zhì)粒即突變RAGE的結(jié)合位點(diǎn),tRAGE第五位精氨酸與第六位谷氨酰胺均突變?yōu)楸彼�。分別用脂質(zhì)體法對HUVECs轉(zhuǎn)染RAGE野生型質(zhì)粒、突變型質(zhì)粒以及對照空載質(zhì)粒,48h后再給予AGEs刺激8h,結(jié)果顯示,與AGEs刺激組相比,預(yù)轉(zhuǎn)染RAGE突變質(zhì)粒組TER下降明顯降低,FITC-dextran漏出明顯減少；而轉(zhuǎn)染了RAGE過表達(dá)質(zhì)粒組與AGEs刺激組相比,TER下降幅度明顯增大、FITC-dextran漏出明顯增多,感染對照空載質(zhì)粒組則無明顯改變。結(jié)果提示：mDia1是通過與RAGE結(jié)合參與到AGEs介導(dǎo)的HUVECs通透性增高這一過程中。2. AGEs通過激活NADPH氧化酶4導(dǎo)致HUVECs ROS水平增高,最終導(dǎo)致HUVECs通透性增高,mDial通過與RAGE相互作用參與其中。(1) AGEs通過激活NADPH氧化酶4導(dǎo)致HUVECs ROS水平增高。AGEs刺激HUVECs,流式細(xì)胞儀檢測HUVECs活性氧ROS產(chǎn)生水平,結(jié)果顯示：100mg/L AGEs能以時間依賴性導(dǎo)致HUVECs ROS產(chǎn)生增加,與對照組相比,10min時差異即有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,15mmin差異最明顯,到刺激30min差異仍有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而預(yù)轉(zhuǎn)染NADPH氧化酶4的siRNA 48h后再用AGEs刺激HUVECs,與AGEs刺激組相比,活性氧ROS產(chǎn)生水平明顯減少,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；control siRNA與相應(yīng)對照組相比,差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果提示AGEs通過激活NADPH氧化酶4導(dǎo)致HUVECs ROS水平增高。(2) mDial通過與RAGE相互作用參與了AGEs介導(dǎo)的HUVECs活性氧水平增高。分別預(yù)轉(zhuǎn)染mDial siRNA和control siRNA^感染mDial干擾型、過表達(dá)型及相應(yīng)對照腺病毒48h后,再給予AGEs 100 mg/L刺激HUVECs,15min后檢測ROS水平,結(jié)果顯示：與AGEs刺激組相比,預(yù)轉(zhuǎn)染mDial siRNA組與感染mDial干擾型腺病毒組的ROS產(chǎn)生明顯減少,control siRNA及對照腺病毒與相應(yīng)對照組相比則無明顯改變；而感染了mDial過表達(dá)型腺病毒組與AGEs刺激組相比,ROS產(chǎn)生明顯增多,感染對照腺病毒組與相應(yīng)對照組相比則無明顯改變。預(yù)轉(zhuǎn)染RAGE野生型質(zhì)粒、突變型質(zhì)粒以及對照空載質(zhì)粒,48h后再以AGEs刺激HUVECs,15min后檢測ROS水平,結(jié)果顯示：與AGEs刺激組相比,預(yù)轉(zhuǎn)染RAGE突變質(zhì)粒組ROS產(chǎn)生明顯減少；而轉(zhuǎn)染了RAGE過表達(dá)質(zhì)粒組與AGEs刺激組相比ROS產(chǎn)生明顯增多,感染對照空載質(zhì)粒組與相應(yīng)對照組相比則無明顯改變。結(jié)果提示：mDial參與了AGEs介導(dǎo)的HUVECs活性氧水平增高,且通過與RAGE結(jié)合發(fā)揮作用。(3) AGEs刺激HUVECs,導(dǎo)致Nox4膜富集(轉(zhuǎn)位),mDial通過與RAGE結(jié)合參與其中。AGEs刺激HUVECs相應(yīng)時間后,提取膜蛋白,采用Western blotting方法檢測Nox4表達(dá),結(jié)果顯示,AGEs刺激HUVECs 15min時,膜蛋白中Nox4表達(dá)最高,提示AGEs刺激HUVECs可導(dǎo)致Nox4膜轉(zhuǎn)位,進(jìn)而使氧化應(yīng)激水平增加；預(yù)轉(zhuǎn)染RAGE野生型質(zhì)粒、突變型質(zhì)粒以及對照空載質(zhì)粒,48h后再以AGEs刺激HUVECs,15min后提取膜蛋白,Western blotting檢測Nox4表達(dá),結(jié)果顯示,與對照組相比,轉(zhuǎn)染野生型RAGE質(zhì)粒組Nox4在膜上表達(dá)增多,而轉(zhuǎn)染RAGE突變型質(zhì)粒組Nox4表達(dá)減少,提示AGEs刺激HUVECs可導(dǎo)致Nox4膜轉(zhuǎn)位,mDial通過與RAGE結(jié)合參與其中。(4)Nox4參與了AGEs導(dǎo)致的HUVECs通透性增高中。預(yù)轉(zhuǎn)染Nox4 siRNA和control siRNA48h后,再給予AGEs 100 mg/L刺激8h,用電阻儀檢測TER,同時以FITC-dextran漏出法測Pa。結(jié)果顯示,與AGEs刺激組相比,預(yù)轉(zhuǎn)染Nox4 siRNA組的TER下降幅度明顯降低、FITC-dextran漏出明顯減少,control siRNA則無明顯改變。結(jié)果提示：Nox4參與了AGEs導(dǎo)致的HUVECs通透性增高中。3.AGEs通過RAGE導(dǎo)致HUVECs Src Y419磷酸化水平增高,mDial通過與RAGE結(jié)合參與其中。AGEs 100mg/L刺激HUVECs相應(yīng)時間,提取總蛋白,Western blotting檢測酪氨酸激酶Src Y419磷酸化水平。結(jié)果顯示：AGEs能呈時間依賴性導(dǎo)致SrcY419磷酸化水平增高。而預(yù)轉(zhuǎn)染RAGE siRNA、mDial siRNA及感染mDial干擾型腺病毒48h后再給予AGEs刺激,與AGEs刺激組相比,轉(zhuǎn)染RAGE siRNA、 mDial siRNA及感染mDial干擾型腺病毒組SrcY419磷酸化水平明顯降低,感染mDial過表達(dá)腺病毒組SrcY419磷酸化水平明顯增高；預(yù)轉(zhuǎn)染RAGE野生型質(zhì)粒48h后再給予AGEs刺激,與AGEs刺激組相比,Src磷酸化水平明顯增高,而轉(zhuǎn)染RAGE突變型質(zhì)粒組Src磷酸化水平明顯降低。結(jié)果提示：AGEs通過RAGE導(dǎo)致HUVECs SrcY419磷酸化水平增高,mDial通過與RAGE結(jié)合在其中發(fā)揮作用。4..氧化應(yīng)激參與AGEs導(dǎo)致的HUVECs Src Y419磷酸化水平增高。預(yù)先孵育NADPH氧化酶抑制劑Apocynin 40min以及預(yù)轉(zhuǎn)染Nox4 siRNA48h后再以AGEs 100mg/L刺激HUVECs,提取細(xì)胞總蛋白,Western blotting檢測SrcY419磷酸化水平。結(jié)果顯示：與AGEs刺激組相比,抑制劑Apocynin組及Nox4 siRNA組Src Y419磷酸化水平明顯降低。結(jié)果提示：氧化應(yīng)激參與AGEs介導(dǎo)的HUVECs Src Y419磷酸化水平增高中,證明氧化應(yīng)激在Src上游發(fā)揮作用。5. AGEs導(dǎo)致HUVECs VE-cadherin Y658磷酸化水平增高,mDial通過與RAGE結(jié)合參與其中。AGEs 100mg/L刺激HUVECs相應(yīng)時間,提取總蛋白,Western blotting檢測VE-cadherinY658磷酸化水平。結(jié)果顯示：AGEs能呈時間依賴性導(dǎo)致VE-cadherinY658磷酸化水平增高。而預(yù)轉(zhuǎn)染mDial siRNA 48h后再給予AGEs刺激,與AGEs刺激組相比,VE-cadherinY658磷酸化水平明顯降低。預(yù)轉(zhuǎn)染RAGE野生型質(zhì)粒48h后再給予AGEs刺激,與AGEs刺激組相比,VE-cadherinY658磷酸化水平明顯增高,而轉(zhuǎn)染RAGE突變型質(zhì)粒組VE-cadherinY658磷酸化水平明顯降低。結(jié)果提示：AGEs可以導(dǎo)致HUVECs VE-cadherinY658磷酸化水平增高,mDial通過與RAGE結(jié)合在其中發(fā)揮作用。6. mDia1、RAGE、Nox4均參與AGEs介導(dǎo)的HUVECs VE-cadherin形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。(1) AGEs介導(dǎo)HUVECs VE-cadherin形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。AGEs 100mg/L刺激HUVECs,不加刺激為對照組,8h后進(jìn)行免疫熒光染色,激光共聚焦顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞鈣依賴性粘附蛋白、VE-cadherin的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變情況。結(jié)果顯示,正常對照組的內(nèi)皮細(xì)胞VE-cadherin存在于細(xì)胞周邊呈環(huán)狀,線條清晰連續(xù),細(xì)胞間連接緊密,無明顯縫隙；AGEs刺激后VE-cadherin線條呈斷裂鋸齒狀,甚至出現(xiàn)中斷,邊緣也變得十分粗糙。結(jié)果提示：AGEs可以介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞VE-cadherin形態(tài)結(jié)構(gòu)改變。(2) mDia1、RAGE、Nox4均參與AGEs導(dǎo)致的HUVECs VE-cadherin形態(tài)結(jié)構(gòu)改變中。預(yù)轉(zhuǎn)染RAGE siRNA、mDial siRNA、Nox4 siRNA、mDial干擾型和過表達(dá)型腺病毒以及RAGE野生型與突變型質(zhì)粒48h后,給予HUVECs 100mg/L AGEs刺激,8h后進(jìn)行免疫熒光染色,激光共聚焦顯微鏡下觀察內(nèi)皮細(xì)胞鈣依賴性粘附蛋白VE-cadherin的形態(tài)結(jié)構(gòu)改變情況。結(jié)果顯示,與AGEs刺激組相比,RAGE siRNA、mDial siRNA、Nox4 siRNA、mDial干擾型腺病毒以及RAGE突變型質(zhì)粒組VE-cadherin形態(tài)結(jié)構(gòu)改變明顯減輕,而mDial過表達(dá)腺病毒組及RAGE野生型質(zhì)粒組VE-cadherin線條中斷,破壞嚴(yán)重,甚至失去原來形態(tài)。結(jié)果證明：mDial、 RAGE、Nox4均參與AGEs導(dǎo)致的HUVECs VE-cadherin形態(tài)結(jié)構(gòu)改變中。結(jié)論：1. AGEs通過與其受體RAGE結(jié)合導(dǎo)致HUVECs通透性增高,mDial通過與RAGE相互作用參與其中。2.AGEs通過與其受體RAGE結(jié)合導(dǎo)致HUVECs發(fā)生氧化應(yīng)激,mDial通過與RAGE相互作用參與其中。3.AGEs通過mDial引發(fā)氧化應(yīng)激而激活酪氨酸激酶Src,表現(xiàn)為Src第419位酪氨酸磷酸化。4.AGEs可介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞鈣依賴性粘附蛋白VE-cadherinY658發(fā)生磷酸化,mDial通過與RAGE相互作用參與其中。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R587.1
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本文編號：1795250