本文選題：B7-1 + 雙價(jià)抗體　； 參考：《蘇州大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：B7-1分子是表達(dá)于抗原遞呈細(xì)胞(antigen presenting cell,APC)表面的重要共刺激分子,其受體是表達(dá)于T細(xì)胞表面的CD28。B7-1分子與CD28結(jié)合轉(zhuǎn)導(dǎo)T細(xì)胞活化的正性共刺激信號(hào)。該信號(hào)具有促進(jìn)抗原特異性T細(xì)胞增殖,分泌細(xì)胞因子,誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞分化及防止T細(xì)胞發(fā)生凋亡等功能。系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus,SLE)是具有自身反應(yīng)性的T、B淋巴細(xì)胞異常活化,產(chǎn)生自身抗體及免疫復(fù)合物等特點(diǎn)的自身免疫性疾病(autoimmune disease,AID)。該病變累及全身,可造成多器官和組織的慢性病變和功能喪失。其中尤其以狼瘡性腎炎(lupus nephritis,LN)為最嚴(yán)重的并發(fā)癥,且是導(dǎo)致SLE患者死亡的主要原因。研究發(fā)現(xiàn),B7-1/CD28信號(hào)通路在SLE疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用,因此阻斷B7-1/CD28信號(hào)通路為自身免疫性疾病SLE的干預(yù)提供了理論依據(jù)。本課題1.運(yùn)用本室自行構(gòu)建的能夠持續(xù)穩(wěn)定分泌鼠抗人B7-1雙價(jià)抗體的基因工程細(xì)胞株SAШ制備并純化雙價(jià)抗體。2.根據(jù)自身免疫性疾病SLE的病理損傷機(jī)制,運(yùn)用Pristane化學(xué)法誘導(dǎo)與人類SLE相似的C57BL/6小鼠狼瘡樣腎炎模型并進(jìn)行鑒定。3.應(yīng)用鼠抗人B7-1雙價(jià)抗體對(duì)該疾病模型進(jìn)行免疫干預(yù)效應(yīng)及其分子機(jī)制的研究。尋找此類疾病治療的新靶標(biāo)及新手段。一、鼠抗人B7-1雙價(jià)抗體的制備及生物學(xué)鑒定目的:制備鼠抗人B7-1雙價(jià)抗體并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行鑒定。方法:采用體外細(xì)胞大規(guī)模培養(yǎng)技術(shù)收集CHO細(xì)胞的培養(yǎng)上清,經(jīng)離心及超濾等預(yù)處理,上Profinity TM IMAC鎳柱進(jìn)行純化;流式細(xì)胞術(shù)分析B7-1雙價(jià)抗體對(duì)細(xì)胞膜型B7-1的識(shí)別;變性及非變性條件SDS凝膠電泳對(duì)該雙價(jià)抗體的雙價(jià)性進(jìn)行鑒定。結(jié)果:上清中抗體蛋白的得率為10mg/L;該抗體與轉(zhuǎn)人B7-1基因的L929細(xì)胞、人的B淋巴瘤細(xì)胞Raji及人的T淋巴瘤細(xì)胞Jurket的結(jié)合率分別為99.3%、97.9%及9.5%;該抗體在變性及非變性條件SDS凝膠電泳得到了27 kDa及53 kDa的目的蛋白條帶。結(jié)論:成功制備了鼠抗人B7-1雙價(jià)抗體。二、pristane誘導(dǎo)小鼠狼瘡樣腎炎模型的建立及生物學(xué)鑒定目的:構(gòu)建pristane所致小鼠狼瘡樣腎炎模型并對(duì)該模型進(jìn)行生物學(xué)鑒定。方法:將8周齡雌性c57bl/6小鼠隨機(jī)分為2組,造模組與陰性對(duì)照組分別10只,造模組予一次性腹腔注射降植烷0.5ml/只,陰性對(duì)照組予一次性腹腔注射生理鹽水0.5ml/只,造模時(shí)間為4個(gè)月。4個(gè)月時(shí),albustix尿蛋白試紙檢測(cè)小鼠尿蛋白含量;間接免疫熒光法檢測(cè)血清中抗雙鏈dna(ds-dna)抗體及抗核抗體(ana)含量;流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾臟中apc、t細(xì)胞及b細(xì)胞的百分率;直接免疫熒光法檢測(cè)腎小球免疫復(fù)合物(immunitycomplex,ic)沉積;he染色觀察腎小球病理改變;透射電鏡觀察腎小球超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果:建模4個(gè)月時(shí),小鼠均出現(xiàn)蛋白尿,蛋白嚴(yán)重程度為+~++,尿蛋白含量為300mg/l~1000mg/l;小鼠血清中均可檢測(cè)到熒光強(qiáng)度較強(qiáng)的抗dsdna抗體和ana;小鼠脾臟中的apc、t細(xì)胞及b細(xì)胞的活化水平顯著高于對(duì)照組(p0.05);小鼠腎小球系膜上ic沉積嚴(yán)重;he染色結(jié)果顯示,小鼠腎小球增大、腎小球囊腔不規(guī)則改變及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)嚴(yán)重;透射電鏡可見腎小球基底膜增厚,腎小球基底膜處有尖銳轉(zhuǎn)角,臟層細(xì)胞及基底膜間可見大量免疫復(fù)合物沉積。結(jié)論:成功建立pristane誘導(dǎo)的小鼠狼瘡樣腎炎模型。三、b7-1雙價(jià)抗體對(duì)小鼠狼瘡樣腎炎的免疫干預(yù)效應(yīng)及分子機(jī)制研究目的:應(yīng)用鼠抗人b7-1雙價(jià)抗體阻斷或削弱b7/cd28信號(hào)通路,對(duì)pristane所致c57bl/6小鼠狼瘡樣腎炎模型的免疫干預(yù)效應(yīng)及可能的分子機(jī)制進(jìn)行研究。方法:按第二部分的方法建模,取雌性c57bl/6小鼠隨機(jī)分為4組,每組5只。對(duì)照組:參照抗體組同一時(shí)間給予等量的生理鹽水;造模組:參照抗體組同一時(shí)間給予等劑量的小鼠igg同型對(duì)照;抗體組:設(shè)首次注射時(shí)間為第1天,于第1、3、5、8、15、43、71、99天分別尾靜脈注射鼠抗人b7-1雙價(jià)抗體10mg/kgw/只;ctx組:設(shè)首次注射時(shí)間為第1天,于第1、8、22、29、43、50、64、71、85、92天分別腹部注射ctx60mg/kgw/只。albustix尿蛋白試紙檢測(cè)小鼠尿蛋白含量;間接免疫熒光法檢測(cè)血清中抗ds-dna抗體及ana含量;流式細(xì)胞術(shù)分析小鼠脾臟中apc、t細(xì)胞及b細(xì)胞的百分率;he染色觀察腎小球病理改變;直接免疫熒光法檢測(cè)腎小球免疫復(fù)合物(ic)沉積;透射電鏡觀察腎小球超微結(jié)構(gòu)變化。結(jié)果:抗體組小鼠尿蛋白含量較造模組顯著降低;抗體組小鼠血清中抗dsdna抗體和ANA的熒光強(qiáng)度較造模組明顯減弱;抗體組小鼠脾臟中的APC、T細(xì)胞及B細(xì)胞的活化水平顯著低于造模組(p0.05);抗體組小鼠HE染色結(jié)果顯示,腎小球增大、腎小球囊腔不規(guī)則改變及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)情況明顯減輕;抗體組小鼠腎小球系膜上IC沉積明顯減輕;抗體組小鼠透射電鏡可見腎小球基底膜增厚明顯減輕,臟層細(xì)胞及基底膜間IC沉積明顯減少。結(jié)論:B7-1雙價(jià)抗體通過阻斷或削弱B7/CD28信號(hào)可降低T、B細(xì)胞的異�；罨�,減少自身抗體的產(chǎn)生,從而減輕免疫復(fù)合物對(duì)腎功能的損傷。因此B7-1雙價(jià)抗體的免疫干預(yù)可逆轉(zhuǎn)pristane所誘導(dǎo)的小鼠狼瘡樣腎炎的病理損傷,提示該抗體對(duì)SLE疾病的治療具有潛在的應(yīng)用價(jià)值。
[Abstract]:B7 - 1 molecule is an important co - stimulatory molecule expressed on the surface of antigen presenting cell ( APC ) . Its receptor is a positive co - stimulatory signal which is expressed on the surface of T cell . It has the functions of promoting antigen - specific T cell proliferation , secretion of cytokines , inducing effector T cell differentiation and preventing T cell apoptosis . Systemic lupus erythematosus ( SLE ) is autoimmune disease ( AID ) characterized by its own reactivity , abnormal activation of B lymphocytes , and the production of autoantibodies and immune complexes . A murine model of lupus - like nephritis induced by human B7 - 1 antibody and its molecular mechanism were studied . The immune intervention effect and molecular mechanism of anti - dsdna antibody and ANA in mouse spleen were studied . The results showed that anti - dsdna antibody and ANA in the spleen of mice were significantly lower than those in control group ( p < 0.05 ) .

【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R593.242

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本文編號(hào)：1749595