本文選題：免疫調(diào)節(jié)劑　切入點：葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶　出處：《河北大學(xué)》2016年碩士論文

【摘要】：目的用葡萄糖-6-磷酸異構(gòu)酶(GPI)混合多肽片段免疫DBA/1小鼠構(gòu)建類風濕性關(guān)節(jié)炎(RA)模型,并進行鑒定。在此基礎(chǔ)上,探究含噻唑烷-4-酮的免疫調(diào)節(jié)劑CH2b對RA小鼠的干預(yù)作用;對體內(nèi)iNKT細胞頻率與功能的影響以及對Th1/Th2、Th17/Treg免疫失衡的影響;并探討iNKT細胞對CH2b可能的識別方式和細胞活化信號通路,為今后RA發(fā)病機制和治療方法的探究提供新的理論依據(jù)。方法1.構(gòu)建并鑒定類風濕性關(guān)節(jié)炎小鼠模型hGPI325-339、hGPI469 483多肽片段與完全弗氏佐劑充分乳化后,于DBA/1小鼠尾根部多點皮下注射,百日咳毒素0 h、48 h腹腔注射加強免疫進行造模。以健康小鼠和hGPI325-339單一肽段誘導(dǎo)的RA小鼠為對照,觀察小鼠體重變化、足踝關(guān)節(jié)紅腫情況;足踝關(guān)節(jié)蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin staining,HE)染色觀察炎細胞浸潤情況;流式細胞技術(shù)(Fluorescence-activated cell sorting,FACS)檢測外周血CD4+T細胞和iNKT細胞頻率;微量樣本多指標流式蛋白定量技術(shù)(Cytometric Bead Array,CBA)檢測血清細胞因子IL-4、IFN-γ、TNF-α、IL-6的水平變化。2.探究免疫調(diào)節(jié)劑CH2b干預(yù)GPI模型小鼠的作用機制及細胞活化通路應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑CH2b對混合肽段誘導(dǎo)的RA模型小鼠進行干預(yù),以α-半乳糖神經(jīng)酰胺(α-GalCer)作為陽性對照,觀察各組小鼠體重變化和足踝關(guān)節(jié)腫脹變化情況;關(guān)節(jié)組織HE染色法觀察炎細胞浸潤情況的變化;FACS檢測全血中iNKT細胞頻率變化,Western-Blot檢測可能參與的信號通路T-Bet、GATA-3的蛋白表達變化情況。3.檢測免疫調(diào)節(jié)劑CH2b對RA小鼠的Th1/Th2、Th17/Treg免疫平衡紊亂的影響應(yīng)用免疫調(diào)節(jié)劑CH2b對混合肽段誘導(dǎo)的RA模型小鼠進行干預(yù),以α-GalCer作為陽性對照,CBA法檢測各組小鼠各期血清中細胞因子IL-4、IFN-γ、TNF-α、IL-6的水平變化;PCR法檢測各組肝組織中T-bet mRNA、GATA-3 mRNA、ROR-γt mRNA、Foxp3mRNA的表達水平。結(jié)果1.混合肽段模型小鼠較健康對照組和單肽片段模型組體重增長緩慢(P0.05);混合肽段誘導(dǎo)的模型小鼠在造模第8天,足趾最先出現(xiàn)紅腫,后爪最先受累,逐漸加重累及四肢,在造模第14天紅腫達到高峰,足踝腫脹嚴重,伴行動不利,后逐漸緩解;HE觀察發(fā)現(xiàn)足踝關(guān)節(jié)有大量炎細胞浸潤,以巨噬細胞與淋巴細胞為主,漿細胞少量出現(xiàn),且其程度明顯強于單肽片段組。外周血CD4+T細胞數(shù)量明顯增多;炎癥高峰期外周血iNKT細胞頻率明顯下降(P0.05),且血清中TNF-α水平顯著升高(P0.05)。2.免疫調(diào)節(jié)劑CH2b和α-GalCer均可顯著改善RA模型小鼠體重增長緩慢、關(guān)節(jié)腫脹情況(P0.05);足踝關(guān)節(jié)炎細胞浸潤減少;顯著升高RA小鼠體內(nèi)iNKT細胞的頻率(P0.05);與健康對照組相比,在造模的第14天,模型組T-bet蛋白表達明顯增高(P0.05),而α-GalCer、CH2b組的GATA-3蛋白的表達明顯增高(P0.05),而其對T-bet蛋白的表達作用與健康對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.模型小鼠經(jīng)α-GalCer、CH2b干預(yù)后,血清中TNF-α、IL-6、IFN-γ水平相比同時期模型組均有降低,在造模第14天降低最明顯(P0.05);與模型組相比,GATA-3 mRNA的表達明顯增高(P0.05);ROR-γt mRNA的水平在各組之間無明顯差異(P0.05);在造模的第14天,模型組T-bet mRNA表達明顯增高(P0.05),α-GalCer組、CH2b組Foxp3 mRNA表達增高(P0.05)。結(jié)論1.GPI混合肽段誘導(dǎo)的RA模型小鼠在免疫學(xué)特征方面,尤其是CD4+T細胞和iNKT細胞免疫病理方面與RA患者尤為接近,可以作為RA免疫機制研究和治療的良好工具。2.免疫調(diào)節(jié)劑CH2b通過激活iNKT細胞的GATA-3活化通路改善GPI混合肽段誘導(dǎo)的關(guān)節(jié)炎狀況,今后有可能成為一類極具應(yīng)用潛能的靶向治療RA的新工具。3.CH2b通過糾正RA小鼠體內(nèi)Th1/Th2、Th17/Treg免疫平衡紊亂,維持免疫耐受,發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)功能,具有潛在的臨床應(yīng)用價值。
[Abstract]:鐩殑鐢ㄨ憽钀勭硸-6-紓烽吀寮傛瀯閰，

本文編號：1714417