本文選題：胰高血糖素樣肽-1　切入點：結(jié)構(gòu)修飾　出處：《中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院》2017年博士論文

【摘要】：糖尿病是以高血糖為特征的代謝性疾病,由胰島素相對缺乏導(dǎo)致糖類代謝功能紊亂引起,如何解決治療達標(biāo)和低血糖癥之間的矛盾以及如何阻止胰島β細胞的功能進行性減退是當(dāng)前治療糖尿病面臨的2大挑戰(zhàn)。腸源性激素胰高血糖素樣肽-1(Glucagon-like peptide-1,GLP-1)因其依賴葡萄糖濃度促進胰島β細胞分泌胰島素來降低血糖水平,不會造成嚴重低血糖而引起廣泛關(guān)注。然而,人體自身產(chǎn)生的GLP-1極易被體內(nèi)的二肽基肽酶4(DPP-IV)降解,其血漿半衰期不足2分鐘,這就大大限制了天然GLP-1分子的臨床應(yīng)用,并且GLP-1受體激動劑的應(yīng)用還未實現(xiàn)口服給藥。此外,人體肝臟和脂肪組織分泌的促胰島生長素(Betatrophin)是近年來才發(fā)現(xiàn)的一種動物激素,已證實它參與機體的脂肪代謝過程,但在能否促進胰島β細胞增殖方面還存在很大分歧。老年β細胞功能喪失是產(chǎn)生糖尿病的主要原因,Betatrophin能否對更大年齡的糖尿病小鼠起作用還有待證明。因此,本文通過對GLP-1進行結(jié)構(gòu)修飾、mGLP-1的化學(xué)合成與生物活性檢測、6×mGLP-1的融合表達與功能研究、Betatrophin的重組表達與功能研究,以期為后續(xù)開發(fā)治愈糖尿病新療法打下基礎(chǔ),現(xiàn)已取得如下進展:1、mGLP-1是通過分別對天然GLP-1分子內(nèi)DPP-IV與胰蛋白酶(Trypsin)敏感位點的氨基酸殘基進行替換(His~7-Ala~8突變?yōu)镠is~7-Gly~8,Lys~(26,34)突變?yōu)镚ln~(26),Asp~(34))以及后續(xù)化學(xué)合成而獲得,和天然GLP-1相比,mGLP-1在體外可有效抵抗Trypsin、胰酶(Pancreatin)的降解,并且依然具有刺激胰島β細胞增殖、促進胰島素分泌、改善小鼠對葡萄糖的耐受性并降低2型糖尿病小鼠(經(jīng)STZ化學(xué)方法誘導(dǎo)而成)血糖水平的活性,并且這種活性更為強效,且不會引起嚴重的低血糖癥。然而,要想在口服給藥途徑上取得活性還有待進一步研究;2、6×mGLP-1是在已有研究的基礎(chǔ)上,通過分別對天然GLP-1分子內(nèi)DPP-IV與Trypsin敏感位點的氨基酸殘基進行替換(His~7-Ala~8突變?yōu)镠is~7-Ser~8/Gly~8,Lys~(26,34)突變?yōu)镚ln~(26),Asn~(34)/Asp~(34))、C末端添加Cys、首尾相連形成6個串聯(lián)重復(fù)、C末端添加His-tag、密碼子優(yōu)化、原核表達與純化等途徑獲得,并且經(jīng)HPLC檢測其純度完全符合實驗要求。研究發(fā)現(xiàn),在體外,6×mGLP-1可以形成二聚體、三聚體,可被Trypsin降解成具有Trypsin抗性的單體,并且不管是6×mGLP-1作為一個整體還是被Trypsin水解成的單體,均能刺激胰島β細胞增殖;在體內(nèi),6×mGLP-1經(jīng)腹腔注射或灌胃口服均能改善小鼠對葡萄糖的耐受性,腹腔注射可以有效降低2型糖尿病小鼠的血糖水平,作用時間可長達16.7個小時,并且不會引起低血糖癥;口服灌胃給db/db小鼠也可產(chǎn)生近4個小時的降血糖效果。血清動力學(xué)結(jié)果顯示,6×mGLP-1能夠以完整的六聯(lián)體形式在小鼠體內(nèi)穩(wěn)定存在長達24小時之久;3、mGLP-1和6×mGLP-1作為天然GLP-1結(jié)構(gòu)類似物/GLP-1受體激動劑,半衰期均得到有效延長,在降糖活性方面也更強效,對6×mGLP-1藥代動力學(xué)的完善以及口服給藥方式的攻克將會使其超越目前市售的所有以皮下注射給藥的GLP-1受體激動劑;4、成熟形式的Betatrophin重組蛋白經(jīng)密碼子優(yōu)化、原核表達與純化等途徑獲得并且經(jīng)SDS-PAGE檢測其純度完全符合實驗要求。本研究發(fā)現(xiàn),在體外,r-Betatrophin不能刺激胰島β細胞增殖,卻可以通過上調(diào)Egr1基因的表達量、下調(diào)ATGL基因的表達水平來刺激HepG2細胞分泌甘油三酯;在體內(nèi),r-Betatrophin經(jīng)腹腔注射可以提高成年和老年KM小鼠血漿的甘油三酯含量,可改善中年和老年KM小鼠對葡萄糖的耐受性,卻對db/db小鼠的糖耐量沒有影響。因此,實驗結(jié)果初步表明,r-Betatrophin具有調(diào)控糖類和脂質(zhì)代謝的雙重作用。Betatrophin對糖脂代謝的影響越來越受到廣泛認可,但對糖類代謝影響的研究也才剛起步不久,相信隨著對Betatrophin影響脂類代謝分子機制的完善以及糖類代謝研究空白的填補,人們對代謝綜合征的治療將會邁出更大一步。本實驗利用基因工程技術(shù)獲得大量具有生物活性的6×mGLP-1融合蛋白以及人Betatrophin重組蛋白。6×mGLP-1融合蛋白體內(nèi)半衰期的有效延長以及口服給藥方式的可行性為研發(fā)2型糖尿病新藥奠定一定的理論和物質(zhì)基礎(chǔ)。Betatrophin重組蛋白通過增強胰島素的活性來改善中老年小鼠對葡萄糖的耐受性,為其參與糖類代謝提供了新的實驗證據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R587.1

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本文編號：1712111