本文選題：TSC1　切入點(diǎn)：TSC2　出處：《上海交通大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：結(jié)節(jié)性硬化癥(Tuberous Sclerosis Complex,TSC)是一種在多器官發(fā)生良性腫瘤的常染色體顯性疾病。該疾病表現(xiàn)出多種臨床病癥,如癲癇、自閉癥、腎血管平滑肌瘤等。結(jié)節(jié)性硬化癥由腫瘤抑制基因TSC1和TSC2發(fā)生突變所致,不同突變導(dǎo)致的病癥和嚴(yán)重程度都不同。這兩個(gè)基因分別編碼的TSC1和TSC2蛋白形成TSC1/2復(fù)合物,在mTOR信號(hào)通路中起到負(fù)調(diào)控的作用。TSC1/2復(fù)合能夠整合上游的氨基酸、生長因子、能量、低氧和細(xì)胞因子等生長信號(hào),轉(zhuǎn)化為TSC1和TSC2不同位點(diǎn)的磷酸化狀態(tài)。TSC2的GTP酶激活蛋白(GAP)結(jié)構(gòu)域活化Rheb(Ras homolog enriched in brain GTPase),從而抑制mTORC1(哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白復(fù)合物1,mammalian target of rapamycin complex 1)的活性,降低細(xì)胞的合成代謝水平。該復(fù)合物的結(jié)構(gòu)學(xué)研究有助于揭示其調(diào)控機(jī)理。本研究表達(dá)和純化人和裂殖酵母Schizosaccharomyces pombe(S.pombe)的TSC1和TSC2蛋白,進(jìn)行結(jié)晶嘗試。我們利用大腸桿菌Escherichia coli(E.coli)表達(dá)TSC1的coiled coil結(jié)構(gòu)域和TSC2的GAP結(jié)構(gòu)域,裂殖酵母TSC1 540-675 aa的MBP(麥芽糖結(jié)合蛋白)融合蛋白表達(dá)較好,但聚合度高;TSC2完整的GAP結(jié)構(gòu)域沉淀,人TSC2 1516-1708 aa可溶,但與人Rheb共點(diǎn)晶不結(jié)晶。用昆蟲細(xì)胞Sf9共表達(dá)裂殖酵母TSC1和TSC2蛋白,TSC1全長(TSC1 FL)和TSC2全長(TSC2 FL)表達(dá)量低;TSC1的C端截短,如1-799 aa、1-718 aa表達(dá)量較高;TSC2的C端截短表達(dá)量不如TSC2 FL;Anti-Flag親和純化Flag-TSC2同時(shí)拉出His-TSC1,可得到純度高的TSC1/2復(fù)合物,解決了TSC1表達(dá)量高于TSC2的問題;TSC1需要一定長度的coiled coil來穩(wěn)定TSC2,部分C端截短的TSC1 1-718 aa或1-799 aa和TSC2FL共表達(dá)有利于提高TSC2的表達(dá)量。裂殖酵母TSC1以二聚體的形式存在;TSC1結(jié)合TSC2,TSC1/2復(fù)合物會(huì)聚合成分子量大于1 MDa的多聚體;TSC2的N端和GAP結(jié)構(gòu)域可以分開,TSC1和TSC2的N端結(jié)合。Expi293F表達(dá)系統(tǒng)適合人TSC1 FL和TSC2 FL的表達(dá),但表達(dá)量較低,截短蛋白的表達(dá)情況不如全長�？傊�,本研究對(duì)TSC1和TSC2的表達(dá)和純化進(jìn)行了深入的探索,闡釋了蛋白的一些結(jié)構(gòu)性質(zhì),研究結(jié)果和提出的方法為TSC1和TSC2的結(jié)晶研究奠定了重要基礎(chǔ)。
[Abstract]:Tuberous Sclerosis complex (Sclerosis) is an autosomal dominant disease that develops benign tumors in multiple organs. Renal angiomyoma, etc. Nodular sclerosis is caused by mutations in tumor suppressor gene TSC1 and TSC2, and the severity and severity of these mutations are different. The TSC1 and TSC2 proteins encoded by these two genes form TSC1/2 complex, respectively. TSC 1 / 2 complex that plays a negative role in the mTOR signaling pathway can integrate upstream growth signals such as amino acids, growth factors, energy, hypoxia and cytokines. The domain of Rheb(Ras homolog enriched in brain GTPase, which was transformed into phosphorylated state of TSC1 and TSC2, inhibited the activity of Rheb(Ras homolog enriched in brain GTPase1 (mammalian rapamycin target protein complex 1 of rapamycin complex 1). The structure of the complex was helpful to reveal its regulatory mechanism. In this study, TSC1 and TSC2 proteins of human and merozoite yeast Schizosaccharomyces pombeia S.pombe. were expressed and purified. We expressed coiled coil domain of TSC1 and GAP domain of TSC2 using E. coli Escherichia coli. The fusion protein of TSC1 540-675 AA was expressed well, but the whole GAP domain of TSC2 was precipitated with high degree of polymerization. Human TSC2 1516-1708 AA was soluble, but it was not crystallized in cosite with human Rheb. The C terminal truncation of TSC1 and TSC2 protein (TSC1 FL1) and TSC2 (TSC2 FL1) were expressed in insect cell Sf9. For example, the C-terminal truncated expression of 1-799aaaAU 1-718aa is lower than that of TSC2 FL-Anti-Flag affinity purification Flag-TSC2, and His-TSC1 can be obtained with high purity TSC1/2 complex. It solves the problem that the expression of TSC1 is higher than that of TSC2. TSC1 requires a certain length of coiled coil to stabilize TSC2. The coexpression of TSC1 1-718aa or 1-799aa or 1-799aa at some C-terminal can increase the expression of TSC2. TSC1 exists in the form of dimer. Combining TSC1 with TSC1 / 2 complexes to synthesize the N-terminal and GAP domains of the polymer TSC2 with a molecular weight of more than 1 MDa, the N-terminal binding system of TSC1 and the N-terminal binding of TSC2. Expi293F expression system is suitable for the expression of human TSC1 FL and TSC2 FL. However, the expression of truncated protein was lower than that of full-length protein. In a word, the expression and purification of TSC1 and TSC2 were deeply explored, and some structural properties of the protein were explained. The results and the proposed methods lay an important foundation for the crystallization of TSC1 and TSC2.
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R596.1

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