本文選題：熱應(yīng)激　切入點(diǎn)：細(xì)胞損傷　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2016年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分熱應(yīng)激損傷作用研究目的:通過(guò)體外、體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究初步探討熱應(yīng)激對(duì)細(xì)胞及組織的損傷作用。方法:1.體外研究。(1)熱應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷作用:分離C57BL/6小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞,接種于六孔板中培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分為4個(gè)大組:37℃空白對(duì)照組、脂多糖(Lipopolysaccharides,LPS)復(fù)合38℃熱應(yīng)激組、LPS復(fù)合40℃熱處理組和LPS復(fù)合42℃熱應(yīng)激組。每大組內(nèi)設(shè)置三個(gè)熱應(yīng)激時(shí)間點(diǎn)(1 h、2 h、4 h)�？瞻讓�(duì)照組細(xì)胞置于37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng)1 h、2 h、4 h;LPS復(fù)合熱應(yīng)激組細(xì)胞在加入LPS(100 ng/ml)預(yù)處理6 h后,分別置于38℃、40℃、42℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1 h、2 h、4 h。處理結(jié)束后,顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率,試劑盒檢測(cè)細(xì)胞乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)的釋放水平。(2)熱應(yīng)激后炎癥細(xì)胞因子的釋放:分離、培養(yǎng)C57BL/6小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞。實(shí)驗(yàn)分為空白對(duì)照組、LPS組、熱應(yīng)激組、LPS復(fù)合熱應(yīng)激組。其中,LPS復(fù)合熱應(yīng)激組細(xì)胞經(jīng)LPS預(yù)處理6 h后,在38℃、40℃、42℃條件下分別孵育1 h、2 h、4 h。ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、白介素-6(IL-6)和腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平。2.體內(nèi)研究。(1)C57BL/6小鼠分為正常對(duì)照組和LPS復(fù)合38℃、40℃和42℃熱應(yīng)激組,每組5只小鼠。LPS復(fù)合熱應(yīng)激組小鼠腹腔注射LPS(1 mg/kg),4 h后給予不同溫度的熱刺激。測(cè)定各組小鼠初始及熱應(yīng)激2 h后(或?yàn)l死時(shí))的肛溫,存活小鼠在熱應(yīng)激2 h后處死,取血測(cè)定血清IL-1β。(2)C57BL/6小鼠分為正常對(duì)照組和LPS組,檢測(cè)LPS處理4 h后小鼠血象變化。(3)C57BL/6小鼠分為正常對(duì)照組、LPS組、熱應(yīng)激組和LPS復(fù)合40℃熱應(yīng)激組,每組10只小鼠。受熱后每隔15 min監(jiān)測(cè)四組小鼠肛溫變化直至達(dá)到熱射病標(biāo)準(zhǔn)42.7℃,記錄生存時(shí)間繪制生存曲線。結(jié)果:1.體外研究。(1)熱應(yīng)激對(duì)細(xì)胞的損傷作用:LPS復(fù)合42℃,4 h熱應(yīng)激處理后,細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化,細(xì)胞萎縮,體積變小,細(xì)胞間隙變大,細(xì)胞膜輪廓模糊,細(xì)胞死亡過(guò)半。LPS復(fù)合40℃,4 h與LPS復(fù)合42℃,2 h熱應(yīng)激處理后細(xì)胞少量死亡。其他處理組細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化。MTT測(cè)定結(jié)果顯示,腹腔巨噬細(xì)胞經(jīng)不同溫度不同時(shí)間熱應(yīng)激后,LPS復(fù)合42℃,4 h熱應(yīng)激組細(xì)胞的存活率較其他組明顯降低,其余各組之間細(xì)胞存活率沒(méi)有明顯差異。LDH測(cè)定結(jié)果顯示,37℃正常孵育1 h、2 h、4 h,細(xì)胞上清中LDH含量均較低,細(xì)胞經(jīng)LPS預(yù)處理后在38℃、40℃、42℃條件下孵育1 h、2 h和4 h,LDH釋放量隨著熱應(yīng)激溫度與時(shí)間的增加有依賴性的升高,其中,LPS復(fù)合42℃,2 h熱應(yīng)激組和LPS復(fù)合42℃,4 h熱應(yīng)激組細(xì)胞LDH的釋放量與空白對(duì)照組相比有顯著差異。(2)熱應(yīng)激后炎癥細(xì)胞因子的釋放:與空白對(duì)照組相比,LPS組、LPS復(fù)合熱應(yīng)激各組細(xì)胞上清中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量均顯著升高。但與LPS組相比,LPS復(fù)合熱應(yīng)激組細(xì)胞上清中僅IL-1β的含量明顯升高,提示LPS復(fù)合熱應(yīng)激僅進(jìn)一步促進(jìn)IL-1β的分泌。2.體內(nèi)研究。(1)LPS復(fù)合熱應(yīng)激2 h(不足2 h的瀕死即刻測(cè)量)后,40℃熱應(yīng)激組小鼠和42℃熱應(yīng)激組小鼠肛溫均高于38℃組。血清ELISA結(jié)果顯示LPS復(fù)合40℃熱應(yīng)激小鼠的血清IL-1β水平高于38℃和42℃熱應(yīng)激組小鼠。(2)LPS(1 mg/kg)處理4 h后,小鼠血液中白細(xì)胞量(White blood cell,WBC)和淋巴細(xì)胞比例(%LYMPH)較空白對(duì)照組相比顯著降低,中性粒細(xì)胞比例(%NEUT)相比于空白對(duì)照組顯著升高。(3)監(jiān)測(cè)正常對(duì)照組、LPS組、熱應(yīng)激組和LPS復(fù)合40℃熱應(yīng)激組小鼠體溫發(fā)現(xiàn),空白對(duì)照組和LPS組小鼠實(shí)驗(yàn)期間前后肛溫?zé)o明顯變化,單純熱應(yīng)激組小鼠肛溫平緩升高。LPS復(fù)合熱應(yīng)激組小鼠受熱15 min后肛溫較單獨(dú)熱應(yīng)激組迅速升高,且率先達(dá)到熱射病標(biāo)準(zhǔn)溫度42.7℃。生存分析結(jié)果顯示,LPS組野生型小鼠在4 h的觀察期內(nèi)未見(jiàn)死亡。單純熱應(yīng)激組野生型小鼠中位生存時(shí)間為2.72 h,平均生存時(shí)間為2.56h;LPS復(fù)合熱應(yīng)激組野生型小鼠的生存時(shí)間明顯縮短,中位生存時(shí)間為1.47 h,平均生存時(shí)間為1.47 h。結(jié)論:LPS復(fù)合熱應(yīng)激對(duì)細(xì)胞有損傷作用,且損傷程度隨著熱應(yīng)激溫度的升高與時(shí)間的延長(zhǎng)而加重。預(yù)先存在的LPS使機(jī)體對(duì)熱的耐受力下降,小鼠易發(fā)生熱射病,生存時(shí)間縮短。第二部分熱應(yīng)激增強(qiáng)LPS誘導(dǎo)的NLRP3炎癥小體激活目的:明確熱應(yīng)激是否可以激活NLRP3炎癥小體。方法:1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。(1)根據(jù)第一部分研究結(jié)果,小鼠腹腔巨噬細(xì)胞在40℃,4h熱應(yīng)激后IL-1β分泌水平與空白對(duì)照組和LPS組均有顯著性差異,且細(xì)胞損傷相對(duì)較輕。因此,確定熱應(yīng)激激活小鼠腹腔巨噬細(xì)胞NLRP3炎癥小體的最佳實(shí)驗(yàn)條件為熱應(yīng)激40℃,4 h。在此基礎(chǔ)上,建立熱應(yīng)激下評(píng)價(jià)NLRP3炎癥小體活性的細(xì)胞模型。實(shí)驗(yàn)分為四組:空白對(duì)照組、熱應(yīng)激組、LPS組、LPS復(fù)合熱應(yīng)激組。空白對(duì)照組細(xì)胞在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中正常培養(yǎng),LPS組細(xì)胞加入LPS(100 ng/ml)預(yù)處理6 h,更換培養(yǎng)基后在37℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng),熱應(yīng)激組細(xì)胞在40℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),LPS復(fù)合熱應(yīng)激組細(xì)胞加入LPS(100 ng/ml)預(yù)處理6 h,更換培養(yǎng)基后在40℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。各組小鼠腹腔巨噬細(xì)胞給予相應(yīng)處理后,收集細(xì)胞培養(yǎng)液上清,ELISA法測(cè)定炎癥因子IL-1β的含量。提取各組細(xì)胞總蛋白,Western Blot法檢測(cè)NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)變化,包括NLRP3、pro-Caspase-1、ASC、p10和pro-IL-1β。(2)提取各組細(xì)胞total RNA,Real-Time PCR檢測(cè)NLRP3炎癥小體相關(guān)組分基因NLRP3、ASC、Caspase-1的表達(dá)變化。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。(1)C57BL/6小鼠按體重隨機(jī)分為正常對(duì)照組、熱應(yīng)激組、LPS組、LPS復(fù)合熱應(yīng)激組,每組5只動(dòng)物。熱應(yīng)激組小鼠放入40℃高溫模擬倉(cāng)(濕度60%±5%)中給予熱應(yīng)激,LPS組小鼠腹腔注射LPS,LPS復(fù)合熱應(yīng)激組小鼠腹腔注射LPS 4 h后與熱應(yīng)激組小鼠一同放入40℃高溫模擬倉(cāng)(濕度60%±5%)中給予熱應(yīng)激。以LPS復(fù)合熱應(yīng)激組小鼠全部死亡時(shí)間為終止時(shí)間,然后取血制備血清,ELISA法測(cè)定IL-1β的含量。(2)同時(shí)取上述各組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的肝組織,提取各組肝組織總蛋白,Western Blot法檢測(cè)NLRP3炎癥小體相關(guān)蛋白的表達(dá)變化,包括NLRP3、pro-Caspase-1、pro-IL-1β、IL-1β和p10。結(jié)果:1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。(1)IL-1βELISA結(jié)果顯示,空白對(duì)照組、LPS組、熱應(yīng)激組的細(xì)胞上清的IL-1β含量均較低,在基礎(chǔ)水平,而LPS復(fù)合熱應(yīng)激組細(xì)胞上清的IL-1β含量較其它三組顯著升高(P0.05)。Western Blot結(jié)果顯示,與空白對(duì)照組相比,LPS復(fù)合熱應(yīng)激組NLRP3、pro-Caspase-1、ASC、p10和pro-IL-1β蛋白表達(dá)水平均升高。(2)PCR結(jié)果顯示,LPS復(fù)合熱應(yīng)激組與其它三組相比,Nlrp3、Asc和Caspase-1基因表達(dá)水平顯著升高(P0.05)。上述結(jié)果表明,經(jīng)LPS預(yù)處理后,40℃孵育4 h可以激活小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞的NLRP3炎癥小體。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。(1)ELISA結(jié)果顯示,與正常對(duì)照組、熱應(yīng)激組和LPS組相比,LPS復(fù)合熱應(yīng)激組小鼠血清的IL-1β分泌水平顯著升高(P0.05)。(2)肝組織Western Blot結(jié)果顯示,LPS復(fù)合熱應(yīng)激促進(jìn)了小鼠肝組織中NLRP3、pro-Caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β蛋白的表達(dá)。(3)下丘腦組織Western Blot結(jié)果顯示,LPS復(fù)合熱應(yīng)激促進(jìn)了小鼠下丘腦中NLRP3、IL-1β和p10蛋白的表達(dá)。結(jié)論:實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,經(jīng)LPS預(yù)處理后,熱應(yīng)激可以激活小鼠原代腹腔巨噬細(xì)胞的NLRP3炎癥小體,促進(jìn)巨噬細(xì)胞NLRP3、pro-Caspase-1、ASC、p10和pro-IL-1β蛋白的表達(dá),以及IL-1β的分泌,Nlrp3、Asc和Caspase-1基因表達(dá)水平上調(diào)。小鼠經(jīng)LPS處理后接受40℃熱應(yīng)激,血清IL-1β水平升高,肝組織中NLRP3、pro-Caspase-1、pro-IL-1β和IL-1β蛋白表達(dá)上調(diào),下丘腦中中NLRP3、IL-1β和p10蛋白表達(dá)上調(diào)。以上結(jié)果表明,LPS復(fù)合熱應(yīng)激在細(xì)胞水平和整體動(dòng)物水平均可激活NLRP3炎癥小體。第三部分NLRP3炎癥小體在熱應(yīng)激損傷中的作用研究目的:探討NLRP3炎癥小體在熱應(yīng)激損傷中的作用。方法:利用與NLRP3炎癥小體相關(guān)的三種基因敲除小鼠,即Nlrp3-/-小鼠、Caspase-1-/-小鼠和Asc-/-小鼠,分別建立熱應(yīng)激損傷的細(xì)胞模型和動(dòng)物模型。1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)野生型(C57BL/6)小鼠、Nlrp3-/-小鼠、Caspase-1-/-小鼠和Asc-/-小鼠的腹腔巨噬細(xì)胞,熱應(yīng)激條件:40℃,4 h,實(shí)驗(yàn)組別包括:空白對(duì)照組、熱應(yīng)激組、LPS組、LPS復(fù)合熱應(yīng)激組。處理結(jié)束后,收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液上清,MTT法檢測(cè)細(xì)胞的存活率,試劑盒檢測(cè)細(xì)胞乳酸脫氫酶(Lactate dehydrogenase,LDH)的釋放水平,ELISA法測(cè)定IL-1β的含量。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。(1)實(shí)驗(yàn)組別包括:空白對(duì)照組(野生型小鼠)、熱應(yīng)激組(野生型小鼠)、LPS組(野生型小鼠)、LPS復(fù)合熱應(yīng)激組(野生型小鼠)、LPS復(fù)合熱應(yīng)激組(Nlrp3-/-小鼠)、LPS復(fù)合熱應(yīng)激組(Caspase-1-/-小鼠)和LPS復(fù)合熱應(yīng)激組(Asc-/-小鼠)。熱應(yīng)激組小鼠放入40℃高溫模擬倉(cāng)中給予熱應(yīng)激,LPS組小鼠腹腔注射LPS,LPS復(fù)合熱應(yīng)激組小鼠腹腔注射LPS 4 h后放入高溫模擬倉(cāng)中給予熱應(yīng)激。然后做以下分析:1)熱應(yīng)激2 h采血制備血清(2 h內(nèi)死亡動(dòng)物瀕死即刻采血),ELISA法測(cè)定血清IL-1β的含量。2)每隔15 min監(jiān)測(cè)各組小鼠肛溫變化。3)記錄各組小鼠的生存時(shí)間,繪制動(dòng)物生存曲線。(2)實(shí)驗(yàn)組別包括:熱應(yīng)激組、LPS復(fù)合熱應(yīng)激組、LPS復(fù)合熱應(yīng)激組+1μg IL-1β中和抗體(IL-1βNeutralizing antibody,IL-1βNA)、LPS復(fù)合熱應(yīng)激組+5μg IL-1βNA,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均為野生型(C57BL/6)小鼠。小鼠腹腔注射LPS 4 h后尾靜脈注射IL-1βNA,隨后立即放入高溫模擬倉(cāng)中給予熱應(yīng)激。然后做以下分析:1)每隔15 min監(jiān)測(cè)各組小鼠肛溫變化。2)記錄各組小鼠的生存時(shí)間,繪制動(dòng)物生存曲線。結(jié)果:1.細(xì)胞實(shí)驗(yàn):(1)各組細(xì)胞上清MTT結(jié)果顯示,LPS復(fù)合熱應(yīng)激后,NLRP3炎癥小體相關(guān)基因敲除組細(xì)胞存活率較野生型小鼠組升高。(2)各組細(xì)胞上清LDH結(jié)果顯示,LPS復(fù)合熱應(yīng)激后,NLRP3炎癥小體相關(guān)基因敲除組細(xì)胞的LDH釋放水平較野生型小鼠組降低。(3)各組細(xì)胞上清ELISA結(jié)果顯示,LPS復(fù)合熱應(yīng)激處理后,野生型小鼠腹腔巨噬細(xì)胞分泌IL-1β的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于空白對(duì)照組、單純熱應(yīng)激組及LPS組,而NLRP3炎癥小體相關(guān)基因敲除組細(xì)胞經(jīng)LPS復(fù)合熱應(yīng)激處理后,IL-1β處于基礎(chǔ)水平,遠(yuǎn)低于野生型小鼠組。2.動(dòng)物實(shí)驗(yàn):(1)動(dòng)物血清ELISA結(jié)果顯示,野生型小鼠經(jīng)LPS復(fù)合熱應(yīng)激后,血清IL-1β水平明顯高于空白對(duì)照組、單純熱應(yīng)激組及LPS組,而NLRP3炎癥小體相關(guān)基因敲除小鼠經(jīng)LPS復(fù)合熱應(yīng)激后,血清IL-1β水平比野生型小鼠明顯降低,與LPS組相當(dāng)。(2)三組基因敲除小鼠的肛溫監(jiān)測(cè)結(jié)果顯示,Nlrp3-/-小鼠、Caspase-1-/-小鼠和Asc-/-小鼠經(jīng)LPS復(fù)合熱應(yīng)激后肛溫均低于野生型LPS復(fù)合熱應(yīng)激組小鼠。(3)生存分析結(jié)果顯示,野生型LPS復(fù)合熱應(yīng)激小鼠中位生存時(shí)間為1.47 h,平均生存時(shí)間為1.52 h。Nlrp3-/-小鼠、Caspase-1-/-小鼠和Asc-/-小鼠經(jīng)LPS復(fù)合熱應(yīng)激處理后,中位生存時(shí)間比野生型明顯延長(zhǎng)(P0.05 or P0.01),分別為2.76 h、2.97 h和2.18 h,平均生存時(shí)間分別為2.72 h、2.87 h和2.14h。(4)靜脈注射5μg IL-1βNA后,小鼠肛溫升高緩慢,低于未經(jīng)IL-1βNA處理的LPS復(fù)合熱應(yīng)激組。(5)給予5μg IL-1βNA后,LPS復(fù)合熱應(yīng)激小鼠的生存時(shí)間明顯延長(zhǎng)。結(jié)論:細(xì)胞實(shí)驗(yàn)及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,NLRP3炎癥小體激活參與熱應(yīng)激損傷進(jìn)程,抑制NLRP3炎癥小體可延長(zhǎng)LPS復(fù)合熱應(yīng)激后小鼠的生存時(shí)間,該作用與抑制NLRP3炎癥小體激活產(chǎn)物IL-1β有關(guān)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R594.1

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 王強(qiáng);程勇;;熱休克蛋白對(duì)細(xì)胞熱損傷的保護(hù)作用與機(jī)制[J];廣東醫(yī)學(xué);2014年03期

2 梁學(xué)武;劉慶華;蔡永輝;何金成;甘乾福;張性雄;蘭海娟;;高溫高濕地區(qū)奶牛熱應(yīng)激綜合控制技術(shù)體系研究[J];中國(guó)農(nóng)學(xué)通報(bào);2011年17期

，

本文編號(hào)：1622193